摘要
外泌体是由细胞分泌的含有miRNA等多种物质的囊泡，可以有效促进毛囊生长、皮肤修复、组织再生。研究发现外泌体中miRNA作用于绵羊毛囊细胞参与毛囊发育和色素沉着。但绵羊血浆外泌体通过皮下毛细血管网作用自身毛发生长的影响还需进一步研究。本试验旨在探究毛用性状存在显著差异的新吉细毛羊与小尾寒羊血浆外泌体中miRNAs对毛发生长作用研究。 本试验选用毛用性状存在显著差异的新吉细毛羊和小尾寒羊为供体试验动物。将脱毛模型小鼠作为受体进行后续试验，分为对照组、新吉细毛羊富血小板血浆外泌体组（PRP-exos）、血小板外泌体组（PLT-exos）、血浆外泌体（PLA-exos）和小尾寒羊血小板血浆外泌体组（PRP-exos）、血小板外泌体组（PLT-exos）、血浆外泌体组（PLA-exos）进行后续试验。使用聚乙二醇双相法（PEG-Dextran）法分离外泌体，利用透射电镜、纳米颗粒跟踪分析技术（NTA）、蛋白免疫印迹（Western blot）进行鉴定，利用考马斯亮蓝染色试验评估PEG-Dextran法分离效果。通过将外泌体注射脱毛小鼠模型皮下，进行小鼠皮肤组织切片观察，统计毛囊数量及直径分析、毛发黑色素含量测定。应用qPCR法和生物信息学分析建立小鼠皮肤miRNA-mRNA库。将miRNA-mRNA库与新吉细毛羊与小尾寒羊血浆外泌体转录组测序交集筛选出Hub miRNA,应用双荧光素酶报告基因验证其与预测靶基因靶向关系。 所提样本在电镜下显示，具有外泌体标志性特征;NTA结果显示，颗粒粒径在30nm-150nm之间，符合外泌体粒径标准;Western blot结果显示，存在外泌体标志性蛋白:肿瘤易感性蛋白（TSG101）、跨膜四超家族蛋白（CD9）;考马斯亮蓝染色结果显示，使用PEG-Dextran方法分离出的外泌体，在35kDa以下蛋白分层最明显。 皮肤组织切片观察结果显示，与NC组和SPE组相比，XPE组小鼠背部毛囊数量显著减少（P＜0.05）;与NC组和XPE组相比SPE组小鼠背部毛囊直径显著增大（P＜0.05）。小鼠背毛黑色素测定结果显示，与NC组和XPE组相比SPE组小鼠背部毛发黑色素显著升高（P＜0.05）。qPCR结果显示，mmu-miR-150、mmu-miR-133b、mmu-miR-31-5p、mmu-miR-433-3p、mmu-miR-218 在 SPE 组的皮肤组织中的相对表达量显著高于XPE组。SPE组和XPE与NC组相比FZD4、SFRP2、Wnt4、CREB1、FZD3、FGF7存在显著差异。 根据新吉细毛羊与小尾寒羊血浆中外泌体转录组测序结果可知，存在差异表达的miRNAs 364个，其中与羊毛细度正相关基因62个，负相关基因302个。qPCR结果显示，oar-miR-218、oar-miR-370、oar-miR-133、oar-miR-29a、oar-miR-27a、oar-miR-485与转录组测序结果一致。 小鼠皮肤组织中miRNAs与转录组测序结果比对后显示，miR-218、miR-150、miR-133b、miR-433-3p趋势一致;双荧光素酶报告结果显示，oar-miR-218与SFRP2存在靶向关系。 皮肤组织切片结果显示，与NC组、MXD组、PLT-MXD相比oar-miR-218组黑色素沉淀速度加快，毛囊数量显著增加(P＜0.05)，毛囊直径无明显差异(P＞0.05)。 本试验使用PEG-Dextran法成功分离外泌体;新吉细毛羊血浆外泌体和小尾寒羊血浆外泌体促进小鼠毛囊数量增加、毛囊直径增大、黑色素含量增加;新吉细毛羊血浆外泌体和小尾寒羊血浆外泌体可通过oar-miR-218靶向SFRP2促进小鼠毛发生长;其中小尾寒羊血浆外泌体对小鼠毛发生长促进效果更优。
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