摘要
禽传染性支气管炎病毒（IBV）是γ冠状病毒（CoV）的代表性成员，是当前世界范围内严重危害家禽养殖业的病原体。已知多种CoV能够通过诱导宿主细胞发生自噬从而促进病毒自身的复制，而自噬的发生及其在IBV感染生活周期中的作用尚未有系统性的研究。 为探究IBV能否诱导细胞自噬及其对病毒复制的影响，本研究利用IBV细胞适应株LDT3/03 CEF adapted（CEA）株分别接种鸡胚成纤维细胞系（DF-1）、原代鸡胚成纤维细胞（CEF）和非洲绿猴肾细胞（Vero），通过Western blot、透射电镜和激光共聚焦显微镜检测自噬通路关键蛋白LC3和P62的表达和分布以及自噬囊泡的形成情况，并通过自噬抑制剂和诱导剂处理评估自噬对IBV复制的影响。Western blot结果显示，IBV CEA株不能在DF-1细胞中诱导LC3的转化，但能够诱导CEF和Vero细胞中LC3-Ⅱ和P62的水平升高，并能在CEF和Vero细胞中诱导形成自噬囊泡。此外，EGFP-LC3-Ⅱ在IBV感染的细胞中向自噬体中聚集，并随之进入溶酶体降解，表明IBV能够在Vero细胞中诱导细胞发生完整自噬。进一步用自噬抑制剂渥曼青霉素和氯喹处理CEF和Vero细胞能够抑制IBV诱导的自噬以及其自身复制，而自噬激活剂雷帕霉素处理则能够促进病毒的复制。上述结果表明IBV CEA株能够在CEF和Vero细胞中诱导自噬的发生，从而促进病毒自身的复制。此外，通过siRNA敲低P62蛋白的表达水平能够抑制IBV诱导的自噬，推测P62参与了 IBV诱导的自噬过程。 进一步研究发现IBV CEA株感染Vero细胞后能够破坏线粒体的正常结构和功能，表现为线粒体肿胀破损、线粒体膜电位降低以及ATP减少，表明IBV CEA株可能通过造成线粒体损伤从而引起线粒体自噬。Western blot检测发现IBV CEA株后导致细胞中MFN1、MFN2和OPA1蛋白水平降低，表明其抑制了线粒体的内、外膜的融合过程。探究线粒体自噬的产生机制发现IBV CEA株感染能够诱导泛素依赖性途径中的关键分子E3泛素连接酶（Parkin）和丝氨酸/苏氨酸激酶（PINK1）的表达水平升高，表明IBV通过引起Parkin和PINK1功能的改变调控线粒体自噬的发生。另外，IBV CEA株诱导的线粒体自噬能够降解线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS），表明其能够拮抗宿主的先天免疫反应。 综上所述，本研究发现IBV CEA株能在CEF和Vero细胞上诱导细胞自噬的发生，从而促进病毒自身的复制，自噬通路上的P62蛋白对于IBV诱导自噬很重要。IBV能够引起线粒体损伤并通过Parkin-PINK1通路引发泛素依赖性的线粒体自噬，通过自噬途径降解MAVS蛋白，阻碍先天免疫传导，这一结果为深入探究IBV致病机理提供了理论基础。
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