摘要
目的:全球范围内，结直肠癌作为第三大常见癌症和第二大癌症致死原因，每年因其死亡人数超百万。过去十几年，我国结直肠癌的发病率和死亡率均显著上升，流行病学数据显示，它是导致肿瘤相关死亡的关键因素之一。目前，越来越多的研究表明NR1D1在多种癌症类型中参与了肿瘤的发生发展，如乳腺癌、肺癌、膀胱癌等。然而，其在结直肠癌中是否扮演着类似的角色和具体功能机制尚不明确。 方法:GEO数据库下载结直肠癌患者单细胞组学数据，通过对数据进行筛选过滤、标准化、主成分分析、细胞聚类和注释，R语言Monocle包进行拟时序和轨迹分析，观察NR1D1在结直肠癌分化过程中的表达变化;基于HPA、GEO和GTEx数据库中NR1D1基因转录组表达数据，Wilcoxon秩和检验计算NR1D1在结直肠癌和正常结直肠粘膜上皮组织之间的表达差异;Kaplan-Meier生存分析用于比较NR1D1高低表达两组患者生存的差异;LASSO回归筛选与结直肠癌预后相关的重要特征并构建Nomogram列线图，通过ROC、Calibration、DCA曲线对模型进行内外部评价;采用LinkedOmics数据库获取结直肠癌中与NR1D1最相关的前100个基因，R语言clusterProfiler包对该100个基因进行功能富集分析;IOBR包中XCELL算法评估NR1D1高低表达组别免疫细胞浸润的丰度和比例差异;Pearson相关性计算NR1D1基因的表达与各免疫检查点基因的相关性;随后，qRT-PCR和Western blot验证正常结直肠粘膜上皮细胞（NCM460）与结直肠癌细胞（HT29、CACO2、SW620）之间NR1D1的表达水平差异;选择结直肠癌细胞CACO2和SW620进行慢病毒NR1D1过表达的稳转细胞株构建;以及转染siRNA的NR1D1敲低的瞬转细胞株构建，采用CCK-8、细胞划痕和Transwell的方法验证NR1D1表达差异对肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响;流式细胞仪检测NR1D1表达差异对细胞凋亡和周期能力的影响。 结果:1.单细胞分析显示随着结直肠癌分化程度的增加，NR1D1基因表达呈下降趋势;2.HPA和转录组数据均显示，与癌旁组织相比NR1D1在结直肠癌中表达显著降低（P＜0.001）;3.NR1D1的低表达与患者的预后不良密切相关 (P=0.036）;4. LASSO回归筛选出NR1D1表达水平、年龄、性别、T分期、N分期、M分期为结直肠癌患者预后的重要特征并构建出预测结直肠癌患者预后的Nomogram列线图，通过ROC、Calibration、DCA曲线对模型进行内外部验证均具备较好的准确性;5.功能富集显示，NR1D1相关的基因集团通过调节肿瘤转录过程中的失调、自噬和昼夜节律等通路调节结直肠癌的进展;6. NR1D1低表达组中，B细胞、CD8+T细胞、M1巨噬细胞、pDC细胞和Th2细胞的浸润丰度较高，而Th1细胞浸润丰度较低;7. NR1D1表达与免疫检查点基因ICOSLG、TNFSF9、CD276、PVR等呈显著正相关;8. qRT-PCR及Western Blot结果发现，NR1D1在结直肠癌细胞系中表达显著降低;9.过表达NR1D1后，结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力受到抑制，加速了细胞的凋亡，并抑制细胞周期的进程;10.NR1D1敲低后，促进结直肠癌细胞发生增殖、迁移和侵袭能力，抑制细胞发生凋亡，并促进了细胞周期的进程。 结论:通过生物信息学分析，我们确认了NR1D1在结直肠癌的进程中发挥着关键的抑癌基因作用。并且，细胞学实验进一步验证了NR1D1的低表达可能对结直肠癌的预后产生不利影响。这些发现不仅突显了NR1D1与结直肠癌之间的密切联系，还为我们提供了深入探究其在结直肠癌发病机制中的作用的重要线索。此外，我们的研究结果为开发针对NR1D1的靶向治疗策略提供了有力的理论支持，有望为结直肠癌患者的个性化治疗带来新的希望。
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