摘要
泛素-蛋白酶体系统是真核生物细胞内特异性降解蛋白质的主要途径。SKP1和F-box蛋白作为该系统中SCF E3泛素连接酶的关键亚基，结合形成SKP1-F-box蛋白复合物，发挥识别并标记待降解底物的作用，影响泛素化过程。尽管SKP1-F-box已被发现多年，但对于特定蛋白复合物(SKP1-FBXL7、SKP1-FBXL12、SKP1-FBXO16、SKP1-FBXW12)的三级结构和相互作用机制仍不明确，限制了对这些复合物泛素化功能的深入理解。鉴于两蛋白相互作用主要位于N端F-box结构域，同时为提高结晶稳定性，本研究采取截短策略，成功构建了 SKP1与四种F-box截短体的体外复合物。 实验首先提取出四种复合物的重组质粒DNA,借助大肠杆菌原核表达系统,明确了最佳的蛋白表达条件。随后，结合Ni-NTA亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等技术进行分离纯化，获得了高纯度的目的蛋白。接着，通过系统的晶体初筛及优化工作，确定了各复合物晶体最佳的生长条件，得到了质量较高的蛋白晶体，并利用同步辐射进行X-射线晶体衍射收集数据。此外，结合AlphaFold2结构模拟技术，构建蛋白复合物结构模型，进一步揭示了蛋白的结构特征及相互作用机制。研究结果总结如下: 蛋白表达纯化实验表明:四种蛋白复合物在大肠杆菌B21(DE3)中，经20℃、0.5-1 mM IPTG诱导14 h实现可溶性高表达，结合两种以上柱层析技术实现高效纯化，纯度达90％以上，满足结晶实验要求。晶体学实验表明:SKP1-FBXL7、SKP1-FBXL12、SKP1-FBXO16 蛋白复合物分别在 0.18 M NH4NO3、21％w/v PEG3350;0.083 M Bicine 9.3、21％w/v PEG Smear Medium、17％w/v PEG 600;20 mM MgCl2、0.1 M Tris-HCl pH 7.5、2.5 M 1,6-Hexanediol条件下，获得了质量较好的蛋白晶体，其中SKP1-FBXL7晶体的最高分辨率为3?,满足结构解析要求。AlphaFold2模拟结果表明:四种蛋白复合物的三维模型评估分数均超过90,结构具有较高准确性。SKP1蛋白由8个α-螺旋和1个α/β超二级结构构成，而四种F-box蛋白则均由3-4个α-螺旋构成，表现出显著的结构保守性。SKP1与四种F-box之间的ΔiG值均低于-20.0 kcal/mol,结合面积均为1500 ?2左右，通过氢键、盐桥等多种作用力相互结合，展现出较高的热力学稳定性及结合稳定性。这种严格的保守性与强烈相互作用确保了人体内泛素化过程的高效有序进行，从而维持细胞稳态与生理功能的正常执行。 本课题通过晶体学实验获得了特定SKP1-F-box蛋白复合物晶体，并利用模拟技术构建了三维空间结构，探究了其相互作用机制，为结构解析和功能研究提供了关键依据，也为相关疾病的治疗提供了新思路。
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