摘要
目的:氧化型肌纤维在提高骨骼肌耐力性能和维持机体能量平衡方面发挥着重要作用。然而，目前调节氧化型肌纤维比例的靶点和手段仍然缺乏。前期研究发现橘皮素(Tangeretin，TG)在体内和体外均能显著提高骨骼肌线粒体的生物发生，而骨骼肌中线粒体功能和数量与氧化肌纤维比例呈正相关，提示橘皮素可能具有增加氧化型肌纤维比例的作用。因此，本研究旨在探讨橘皮素对氧化型肌纤维的调控作用，同时筛选橘皮素调控氧化型肌纤维比例的关键作用靶点并研究其作用机制，进一步揭示其调节氧化型肌纤维比例的分子机制。 方法:(1) 30只8周龄雄性C57BL/6J小鼠被随机分为对照组(CON)、25mg/kg橘皮素组(TG25)和50mg/kg橘皮素组(TG50)，连续灌胃12周，每周记录小鼠体重和进食量。干预结束后，通过代谢笼和小动物身体成分分析仪监测小鼠的代谢情况和身体成分;通过测试四肢抓力大小、四肢悬挂时间以及低、高速跑时间和距离检测小鼠的运动能力;通过生化试剂盒检测腓肠肌中琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydrogenase，SDH)和乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)活性;通过RT-qPCR和WB检测小鼠腓肠肌和比目鱼肌中肌纤维相关标志物基因和蛋白的表达，并通过SDH、ATPase染色和免疫荧光染色观察各组小鼠氧化型肌纤维比例。 (2)使用0μM、5μM、10μM和20μM浓度的橘皮素干预C2C12细胞24小时，通过生化试剂盒检测SDH和LDH活性;通过RT-qPCR、WB和免疫荧光染色检测肌纤维相关标志物基因、蛋白的表达以及不同类型肌纤维比例。 (3)采用蛋白质组学、分子动力学、药物亲和反应的靶点稳定性(Drug affinity responsive target stability,DARTS)和细胞热位移(Cellular thermal shift assay,CETSA)等实验方法筛选橘皮素调控氧化型肌纤维比例的靶标蛋白，并验证橘皮素与靶标蛋白的直接结合。 (4)使用脂联素受体 1 (Adiponectin receptor 1，AdipoR1)慢病毒转染 C2C12细胞，橘皮素干预24小时后，通过WB检测AdipoR1及其下游信号通路的表达情况;通过生化试剂盒检测酶活性;通过RT-qPCR、WB和免疫荧光染色检测C2C12细胞中肌纤维相关标志物基因、蛋白的表达以及不同类型肌纤维比例。 (5)将20只野生型和骨骼肌特异性AdipoR1敲除小鼠随机分为野生型组(WT)、野生型+50mg/kg橘皮素组(WT+TG)、骨骼肌特异性AdipoR 1敲除组(AdipoR1 mKO)和骨骼肌特异性AdipoR1敲除+50mg/kg橘皮素组(AdipoR1 mKO+TG)。橘皮素干预12周后，检测各组小鼠的身体成分、运动能力、代谢能力和不同类型肌纤维比例。 结果:(1)橘皮素提高小鼠的运动耐力、有氧代谢能力和增加氧化型肌纤维比例，但未显著改变小鼠体成分相关指标。与CON组相比，TG组小鼠体重、进食量、腓肠肌指数、比目鱼肌指数、脂肪重量和瘦体重没有显著差异。行为学测试结果显示:橘皮素干预延长了小鼠的四肢悬挂时间、低速跑时间和距离(P＜0.05)，但没有影响四肢抓力大小和高速跑时间。代谢率监测和酶活性结果显示:TG组小鼠的VO2和VCO2显著高于CON组，且TG组小鼠腓肠肌SDH活性升高，LDH活性降低(P＜0.05)。RT-qPCR和WB结果显示:与CON组相比，TG组小鼠腓肠肌和比目鱼肌中氧化型肌纤维相关标志物MyHCI、MyHCIIa、Tnnt1和Tnni1的mRNA水平以及MyHCI的蛋白表达水平升高(P＜0.05)，糖酵解肌纤维相关标志物MyHCIIb、Tnnt3和Tnni2的mRNA水平以及MyHCIIb的蛋白表达水平降低(P＜0.05)。SDH、ATPase染色和免疫荧光染色结果显示:橘皮素增加了氧化型肌纤维比例，降低了糖酵解型肌纤维比例(P＜0.05)。 (2)橘皮素提高C2C12细胞氧化酶活性和增加氧化型肌纤维比例。酶活性检测结果显示:随着橘皮素浓度升高，SDH活性逐渐增加，LDH活性降低(P＜0.05)。RT-qPCR、WB和免疫荧光结果显示:橘皮素增加了C2C12细胞中氧化型肌纤维相关标志物的mRNA水平和蛋白表达以及氧化型肌纤维比例，降低了糖酵解肌纤维相关标志物的mRNA水平和蛋白表达以及糖酵解型肌纤维比例(P＜0.05)。 (3) AdipoR1被确定为橘皮素调控氧化型肌纤维比例的直接靶蛋白。DARTS样品经SDS-PAGE分离后，使用考马斯亮蓝染色，在35-48kDa处观察到一个差异条带，经质谱分析确定了5个可能与橘皮素结合的候选靶蛋白( Lat1、Gpd1l、AdipoR1、Fbx118和Hdac8)。将候选蛋白的慢病毒分别转染C2C12细胞，橘皮素干预24小时后，通过RT-qPCR检测MyHCI的表达，结果显示只有转染AdipoR1慢病毒的C2C12细胞在橘皮素干预后MyHCI的mRNA水平没有出现显著差异(P＞0.05)，提示AdipoR1可能是橘皮素调控氧化型肌纤维比例的靶蛋白。分子对接和分子动力学模拟预测结果显示，橘皮素能使AdipoR1蛋白结构变得更加稳定，并且它们之间具有很低的结合自由能(-30.17±2.81 kcal/mol)CETSA结果显示，与DMSO组相比，橘皮素处理细胞后AdipoR1蛋白的热稳性增加;在特定温度下加热样品，AdipoR1的可溶性蛋白随着橘皮素浓度的增加逐渐增多。DARTS结果显示，随着橘皮素浓度的增加，链霉蛋白酶E对AdipoR1的酶解作用逐渐降低。 (4)橘皮素通过激活AdipoR1信号通路增加小鼠和C2C12细胞氧化型肌纤维比例。WB结果显示，橘皮素可以激活小鼠腓肠肌、比目鱼肌和C2C12细胞中AdipoR1及其下游AMPK和PGC-1α的蛋白表达(P＜0.05);然而，在AdipoR1敲低的细胞中，橘皮素对AdipoR1信号通路的激活作用被显著削弱(P＞0.05)。酶活性检测、RT-qPCR、WB和免疫荧光结果显示:橘皮素对AdipoR1敲低的细胞中SDH和LDH活性以及不同类型肌纤维的调控作用明显减弱(P＞0.05),而橘皮素对正常细胞中不同类型肌纤维的调控作用与之前结果一致。 (5) AdipoR 1介导橘皮素提高小鼠运动耐力、有氧代谢能力和增加氧化型肌纤维比例的作用。体成分结果显示:橘皮素对各组小鼠的生长性能和身体成分没有显著影响(P＞0.05)。在WT小鼠中，再次验证了橘皮素具有提高小鼠运动耐力、改善有氧代谢能力和调控氧化型肌纤维比例的作用(P＜0.05);然而在AdipoR1 mKO小鼠中，AdipoR1 mKO组和AdipoR1 mKO+TG组小鼠之间没有显示出明显的运动能力差异和身体代谢差异(P＞0.05)。RT-qPCR、WB、免疫荧光染色和酶染色结果显示:敲除小鼠骨骼肌中AdipoR1的表达显著削弱了橘皮素对小鼠氧化型肌纤维比例的调控作用(P＞0.05)。 结论:(1)橘皮素可以改善小鼠的运动耐力和有氧代谢能力。 (2)橘皮素可以增加小鼠和C2C12细胞中氧化型肌纤维比例。 (3)橘皮素通过靶向并激活AdipoR1/AMPK/PGC-1α通路增加氧化型肌纤维比例。 (4) AdipoR1在橘皮素调控C2C12细胞和小鼠氧化型肌纤维比例中发挥关键作用。
NETL