摘要
研究目的: 本研究拟进一步探讨VISTA在脓毒症ALI时对巨噬细胞M1型极化的影响与可能作用，并初步探讨其潜在机制，从而为改善脓毒症急性肺损伤的救治提供新的思路。 研究方法: 1、体外实验 （1）使用小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（RAW264.7细胞），探究VISTA表达变化与LPS诱导巨噬细胞向M1型极化之间的关系 首先使用 0ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml LPS 刺激 6h，转录水平检测 VsirmRNA表达变化;使用100ng/mlLPS刺激0h、1h、3h、6h、9h、12h,转录水平检测Vsir、il-6、tnfα mRNA表达变化以及使用酶联免疫吸附法检测培养基上清中炎症因子IL-6浓度变化;使用100ng/ml LPS刺激0h、12h、18h、24h、48h,蛋白水平检测VISTA表达变化。 （2）使用C57BL/6背景野生型小鼠骨髓来源巨噬细胞（bone marrow derived macrophage,BMDM），探究VISTA表达变化与LPS诱导巨噬细胞向M1型极化之间的关系 使用 100ng/ml LPS 刺激 0h、1h、3h、6h、9h、12h,转录水平检测 Vsir mRNA表达变化;使用100ng/mlLPS刺激0h、24h,蛋白水平检测VISTA表达变化。 （3）使用siRNA敲减RAW264.7细胞VISTA的表达，探究在LPS诱导巨噬细胞向M1型极化时，VISTA基因敲减对巨噬细胞向M1型极化的影响 实验分组分为siNC对照组、siNC+LPS组、si Vsir对照组、siVsir+LPS组，使用VISTA siRNA干扰40h后再使用100ng/ml LPS刺激9h,转录水平检测il-6、ccl2 mRNA表达变化;使用VISTA siRNA干扰56h后再使用100ng/ml LPS刺激24h,蛋白水平检测iNOS表达变化。 （4）使用C57BL/6背景VISTA全身性基因敲除小鼠BMDM，探究在LPS诱导巨噬细胞向M1型极化时，VISTA基因敲除对巨噬细胞向M1型极化的影响 实验分组分为WT对照组、WT+LPS组、KO对照组、KO+LPS组，使用100ng/ml LPS刺激9h,转录水平检测il-6、inos mRNA表达变化;使用100ng/ml LPS刺激24h,蛋白水平检测iNOS表达变化。 2、体内实验 （1）使用C57BL/6背景野生型小鼠，探究在气管内注射LPS致小鼠ALI模型中，肺组织损伤严重程度、肺组织炎症反应变化以及VISTA在该模型中的表达变化 使用6～8周龄雄性小鼠，气管内注射LPS（5mg/kg）致小鼠ALI,随机分为造模0h、3h、6h、12h、21h、24h组，每组各6只，转录水平检测Vsir、il-1β mRNA表达变化，酶联免疫吸附法检测肺组织中炎症因子IL-6浓度变化;蛋白水平检测VISTA表达变化;根据所检测到的肺组织炎症反应有显著变化的时间点，再随机分为造模Oh、6h、12h组，每组各6只，使用H&E病理染色进一步观察肺组织损伤严重程度。 （2）使用C57BL/6背景野生型小鼠和VISTA全身性基因敲除小鼠，探究气管内注射LPS致小鼠ALI模型中，肺组织损伤的严重程度 使用6～8周龄的野生型和VISTA全身性基因敲除雄性小鼠，气管内注射LPS（5mg/kg）致小鼠ALI，随机分为WT对照组，WT+LPS组，KO对照组，KO+LPS组，使用H&E病理染色进一步观察野生型和VISTA全身性基因敲除小鼠肺组织在造模后12h的损伤严重程度。 （3）使用VISTA全身性基因敲除小鼠，探究气管内注射LPS致小鼠ALI模型中,VISTA基因敲除对肺组织中巨噬细胞M1型相关基因的表达以及肺泡巨噬细胞向M1型极化的影响 3、VISTA影响巨噬细胞M1型极化的初步机制探究 使用C57BL/6背景野生型小鼠和VISTA全身性基因敲除小鼠的肺组织以及小鼠BMDM初步探究VISTA调控巨噬细胞向M1型极化的机制。 结果: 1、在LPS诱导巨噬细胞向M1型极化时VISTA表达降低 （1）使用 0ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml LPS 刺激 RAW264.7细胞6h,随着LPS浓度升高，Vsir mRNA的表达水平逐渐降低;当LPS浓度＞100ng/ml时，Vsir mRNA的表达水平不再显著下降。使用100ng/ml LPS刺激RAW264.7细胞0h、1h、3h、6h、9h、12h 后，Vsir mRNA 表达从 LPS 刺激 1h 后开始降低;使用 100ng/ml LPS刺激0h、12h、18h、24h、48h后，VISTA蛋白表达从LPS刺激18h后开始降低。 （2）使用 1 00ng/ml LPS 刺激 BMDM 细胞，0h、1h、3h、6h、9h、12h 后，Vsir mRNA表达从LPS刺激1h后开始降低;使用1 00ng/ml LPS刺激0h、24h后，VISTA蛋白表达在24h显著降低。以上结果提示，VISTA在LPS诱导巨噬细胞向M1型极化的过程中可能具有重要作用。 2、VISTA基因敲减或敲除进一步促进LPS诱导巨噬细胞向M1型极化 （1）在RAW264.7细胞上，先使用VISTA siRNA敲减VISTA基因表达，再给予LPS刺激细胞，进一步促进M1型相关基因il-6、ccl2 mRNA表达升高和iNOS蛋白表达升高。 （2）在小鼠BMDM上，给予LPS刺激细胞后，VISTA基因敲除促进M1型相关基因il-6、inos mRNA表达水平升高和iNOS蛋白表达升高。以上结果提示VISTA基因敲除可进一步促进巨噬细胞向M1型极化 3、在气管内注射LPS致小鼠ALI模型中，肺组织损伤严重程度随造模时间延长而加重，VISTA表达降低 使用气管内注射LPS（5mg/kg）致野生型小鼠ALI，0h、3h、6h、12h、21h、24h后，肺组织il-1β mRNA表达水平在前6h时表达逐渐升高，6h时达顶峰，随后则开始显著下降;肺组织IL-6浓度在前3h逐渐升高，3h时达顶峰，随后开始逐渐下降;H&E病理染色进一步观察到在肺组织炎症因子表达发生显著变化时，造模后12h的肺组织损伤程度较6h肺组织损伤程度更严重。Vsir mRNA表达在气管内给予LPS刺激3h后表达降低而后又逐渐升高;VISTA蛋白表达在6h后表达逐渐降低。以上结果提示，VISTA可能在气管内注射LPS致小鼠ALI模型中具有重要作用。 4、VISTA基因敲除加重小鼠ALI肺组织损伤严重程度 使用气管内注射LPS（5mg/kg）致小鼠ALI，12h后H&E病理染色观察到VISTA基因敲除小鼠肺组织病理评分较野生型小鼠肺组织病理评分显著升高，该结果提示VISTA基因敲除加重小鼠ALI肺组织损伤严重程度。 5、VISTA基因敲除促进小鼠ALI肺组织中M1型相关基因表达升高 在气管内注射LPS（5mg/kg）致小鼠ALI模型中，与野生型小鼠相比，VISTA基因敲除小鼠肺组织il-6、inos mRNA表达水平以及iNOS蛋白表达水平显著升高。以上结果提示，VISTA基因敲除促进气管内注射LPS致小鼠ALI时肺组织中M1型相关基因的表达升高。 6、VISTA基因敲除进一步促进小鼠ALI时肺泡巨噬细胞向M1型极化 在气管内注射LPS（5mg/kg）致小鼠ALI模型中，VISTA基因敲除小鼠肺泡巨噬细胞表面CD86+表达量较野生型小鼠肺泡巨噬细胞表面CD86+表达量显著增加。该结果提示VISTA基因敲除进一步促进肺泡巨噬细胞向M1型极化。 7、VISTA影响p-stat1、IRF1表达从而影响巨噬细胞向M1极化 气管内注射LPS（5mg/kg）致小鼠ALI造模12h后，肺组织中p-stat1表达升高，VISTA基因敲除进一步促进p-stat1表达水平升高。使用100ng/ml LPS刺激小鼠BMDM 24h后，p-stat1、IRF1表达升高，VISTA基因敲除进一步促进p-stat1、IRF1的表达水平升高。以上结果提示，VISTA通过影响p-stat1、IRF1表达从而影响巨噬细胞向M1型极化。 结论: 在LPS诱导巨噬细胞向M1型极化时，VISTA表达降低，VISTA可能与巨噬细胞向M1型极化有关。敲减或敲除VISTA表达可进一步促进LPS诱导巨噬细胞向M1型极化。在气管内注射LPS致小鼠ALI模型中，肺组织VISTA表降低，VISTA基因敲除进一步加重肺损伤，促进肺组织中M1型相关基因表达升高并促进肺泡巨噬细胞向M1型极化。针对潜在机制的初步探究表明，VISTA影响p-stat1、IRF1表达从而部分影响巨噬细胞向M1型极化。本研究有助于为通过调控巨噬细胞极化救治脓毒症ALI提供新的思路。
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