摘要
二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic Acid，DHA）是神经系统细胞发育的关键元素，是构成脑部和视网膜的必需脂肪酸，对于婴儿的智力和视力发育至关重要。DHA具有的多种生物学效应决定了其在市场上的广泛前景和研究价值。目前市场上的DHA主要以甘油酯形式存在，利用脂肪酶催化DHA甘油酯的合成，以其简单、效率高、产量大且环保的优点而备受关注。但商用的诺维信435脂肪酶价格昂贵，因此，开发出成本更低廉的实验室自制脂肪酶是本研究的关键所在。 本研究通过使用经过遗传改造的毕赤酵母（Pichia Pastoris）合成的南极假丝酵母脂肪酶B（Candida Antarctica Lipase B,CALB）,以甘油或葡萄糖作为唯一的碳源，解决了传统的以甲醇诱导的毕赤酵母发酵过程中的诸多问题，如过程控制不便、产品毒性和食品安全隐患等。通过对信号肽的筛选、培养基中的氮源和碳源以及发酵过程中溶氧条件的优化，实现了摇瓶发酵条件下CALB的表达量达到0.206 g/L，而在发酵罐中发酵144 h后，CALB产量可达到2.274g/L,水解酶活达到了 93.3 U/mL,24h的油酸甲酯酯化率能达到62.6％。 运用Fireprot对CALB序列进行热稳定性预测，得到12种单突变方案。经基因工程技术改造后测试，筛选出2种突变体Tm值较野生型提高10℃左右。后续的热稳定性验证实验发现，80℃下热孵1h后，野生型CALB的24h油酸甲酯酯化率下降了 41.0％,水解酶活下降了 42.5 U/mL,相较于40℃下的水解酶活还剩余35.0％;而突变体CALB-Q231F的24h油酸甲酯酯化率只下降了 7.5％,水解酶活只下降了 12.5 U/mL,相较于40℃下的水解酶活还剩余77.0％,是野生型CALB的水解酶活保留率的2.2倍。因此，突变体CALB-Q231F的热稳定性要明显优于野生型CALB。 通过酯化实验和随后的液相色谱-质谱（LC-MS）分析产物发现，目前发酵合成的CALB在催化DHA甘油酯的酯化反应中，更倾向于合成DHA甘油二酯，占总产物含量的48.8％。在野生型CALB催化DHA甘油酯的酯化实验中，40℃下反应168 h酯化率达到了 92.1％,50℃下无酯化活性;而在突变体CALB-Q231F催化DHA甘油酯的酯化实验中，40℃下反应48 h酯化率达到了 49.3％,50℃下仍有酯化活性，反应91h酯化率能达到92.1％。
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