摘要
背景与目的： 脓毒症（sepsis）常与高死亡风险及不良预后密切相关，目前仍无脓毒症的特效治疗方法。肠道菌群在脓毒症发病及进展中的作用逐渐被发现及证实，中性粒细胞在其中可能发挥着重要作用。中性粒细胞弹性蛋白酶（Neutrophil elastase，NE）是中性粒细胞发挥功能所释放的主要蛋白酶之一，可代替中性粒细胞发挥其免疫防御和炎症反应调节功能。有研究发现，NE的过度释放可通过改变肠道屏障通透性、致使肠道微生物组失调从而影响胃肠炎的发病过程。在脓毒症期间，机体对感染的反应诱使中性粒细胞活化并大量释放NE,已被证明与脓毒症炎症风暴及重要脏器损伤相关，但NE对脓毒症肠道稳态方面的影响尚不明确。我们假设NE可加重脓毒症肠道菌群失调，进而影响菌群代谢物及机体炎症反应，而作为NE的高选择性抑制剂，西维来司他钠的应用可改善这一过程从而对疾病产生有益作用。 材料与方法： 1、采用盲肠结扎穿刺法（Cecum ligation and puncture method，CLP）构建脓毒症动物模型。将60只成年Sprague-Dawley大鼠随机分为三组:假对照组（Sham control,SC组）、脓毒症组（CLP组）和脓毒症+NE抑制剂（西维来司他钠，Sive组）。SC组大鼠除盲肠未结扎穿刺外，其余步骤与CLP组一致。 2、追踪大鼠造模后24小时内的存活情况。 3、无菌收集存活大鼠的结肠内粪便，并提取粪便DNA,选择V3和V4区域作为测序区域进行PCR扩增并对PCR产物进行定量测定，并进行16S核糖体RNA（16S ribosomal RNA,16SrRNA）微生物组测序。读取各组测序数据并通过截取、过滤、嵌合体序列去除等步骤获得测序有效数据，随后对有效数据进行可操作分类单元（Operational Taxonomic Unit,OTUs）聚类、物种注释、多样性分析等，最终获得各组肠道微生物组学特征。 4、提取粪便代谢产物并进行质量控制，使用超高效液相色谱仪和UPLC BEH Amide色谱柱进行代谢物的色谱分离，使用Thermo Q Exactive HFX质谱仪采集质谱数据。对数据依次进行预处理、归一化、质谱数据库匹配、代谢物注释、主成分分析、差异代谢物鉴定及代谢富集分析等，最终获得各组肠道代谢谱差异。 5、对差异菌群及代谢物进行基于Pearson相关性检验的综合差异微生物-代谢物网格分析。 结果： 1、存活率比较 SC组大鼠的24h存活率为100％,CLP组的存活率降为50％，且该组大鼠明显表现出寒战、虚弱、四肢厥冷等脓毒症常见临床症状，提示脓毒症造模成功。而Sive组大鼠的存活率升至80％,明显高于CLP组（P=0.047）。 2、微生物组分析结果与SC组相比，CLP组肠道菌群结构发生显著变化，如在门水平上，CLP组的优势菌厚壁菌门（Firmicutes）的丰度明显低于SC组、变形菌门（Proteobacteria）的丰度高于SC组，以上变化在Sive组被逆转，Sive组整体菌群结构有恢复至与SC组相似的趋势。PCoA及LEfSe分析同样显示，与CLP组相比，Sive组和SC组的肠道菌群结构更为相似。此外，我们鉴定出了Sive组与CLP组的36个主要差异OTUs,并按照科、属水平进行分类，发现Sive组大肠埃氏菌属-志贺氏菌属（Escherichia-Shigella）、γ变形菌（Gamma-proteobacteria）等潜在致病菌的丰度明显降低，以乳酸杆菌（Lactobacillus）为代表的有益菌的丰度增多，提示NE抑制剂西维来司他钠在脓毒症中可以通过增加有益菌并减少致病菌的定植来改善菌群失调。 3、代谢组学分析结果与SC组相比，CLP组大鼠的代谢谱明显改变，而西维来司他钠给药后其代谢谱有恢复至SC组的趋势。我们按照VIP＞1,P＜0.05的标准共鉴定出了 2-甲基苯甲酸、[6]-姜二醇3,5-二乙酸酯、胸腺嘧啶核糖核苷、L-酪氨酸、6-氨基青霉烷酸、莽草酸、[4]-姜二醇3,5-二乙酸酯、可的松、L-别苏氨酸、γ-谷氨酰亮氨酸和油酰甘氨酸共11种代谢物在Sive组和CLP组间存在显著差异，这些差异代谢物大部分为有机酸及其衍生物，且彼此之间具有较强的相关性。对比SC组大鼠中这11种代谢物的含量发现,CLP组[6]-姜二醇3,5-二乙酸酯和γ-谷氨酰亮氨酸水平较SC组显著降低，而西维来司他钠治疗后水平回升（P＜0.05）。通路富集分析显示，受西维来司他钠影响的代谢物主要参与调节苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成等氨基酸代谢途径。 4、综合差异微生物和代谢物网络分析结果我们通过对差异菌群及代谢物进行相关性分析发现，几乎所有受西维来司他钠影响的细菌都与一个或多个CLP组和Sive组间的差异代谢物相关（P＜0.05）,如乳酸杆菌和多种氨基酸，提示西维来司他钠治疗对脓毒症肠道代谢谱的改变可部分归因于其对肠道微生物组的影响，最终对疾病产生有益作用。 结论： NE抑制剂西维来司他钠可通过改善脓毒症肠道菌群失调进而影响相关代谢谱来提高脓毒症大鼠的生存率。
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