摘要
随着“绿色纺织、清洁生产”理念的倡导，在苎麻脱胶领域，如何引入生物酶法以减少碱的用量成为研究的热点。在果胶酶中，果胶裂解酶可通过 β-消除反应使果胶分子内部 α-1, 4 糖苷键直接断裂而分解果胶质，该反应具有反应速度快且不产生甲醇等有害物质的优点，因而果胶裂解酶成为近年来最受关注的苎麻脱胶用酶制剂。然而已报道的果胶裂解酶酶学性质不够优良，酶脱胶过程仍需添加NaOH，造成环境污染，限制了酶法脱胶的应用。为了获得酶学性质优良的果胶裂解酶，本研究从自然环境中筛菌，利用基因克隆表达技术，得到具有高比活力及嗜中温嗜弱碱的重组果胶裂解酶。通过多方面比较重组果胶裂解酶单独使用及与 NaOH 联用所得的脱胶效果，得出“本论文所得的酶可为绿色环保的酶脱胶工艺提供了新的酶制剂选择”的结论，为高效的生物化学脱胶工艺提供了新的参考。 本论文取得的主要研究结果如下： （1）野生型果胶裂解酶产生菌株的筛选与鉴定。以富含桔皮的培养基为筛选培养基，从 58 份土壤样品中筛选出一株能在中温条件下产弱碱性果胶裂解酶的细菌 B58-2。B58-2在 LB平板上的单菌落为乳白色，形状近似圆形，菌落表面呈褶皱状。通过革兰氏染色实验观察得到其为椭圆形短杆状，为革兰氏阳性菌。结合生理生化实验结果和16S rRNA序列分析结果，将B58-2鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。 （2）果胶裂解酶基因的异源表达及酶学性质表征。从 B. velezensis B58-2的基因组DNA中扩增出果胶裂解酶基因BvelPL1，并在大肠杆菌中实现可溶性表达。BvelPL1蛋白与果胶裂解酶Pel（GenBank:AFH66771.1）的一致性最高，为 78.75%，属于较为新颖的果胶裂解酶。构建出的BvelPL1蛋白的同源模型结果表明，其三维结构为平行β-螺旋结构。此外，通过与已报道的果胶裂解酶序列作比较，发现 BvelPL1 的 Asp186、Asp225和Asp229参与Ca2+的结合。经镍柱纯化所得的重组酶rBvelPL1-Ec 的比活力为 2433.26 U/mg，高于大部分已报道的果胶裂解酶；rBvelPL1-Ec的最适pH为8.5，最适温度为50℃，属于中温弱碱性果胶裂解酶；Ca2+能够显著提升酶活力，0.4 mM Ca2+能够将rBvelPL1-Ec酶活力提升23.28倍；Ca2+还能提高该酶的热稳定性，0.4 mM Ca2+存在的情况下，在45℃保温1 h后，rBvelPL1-Ec的残余酶活力从无Ca2+时的65%提升到90%；rBvelPL1-Ec对聚半乳糖醛酸的Km值和Vmax值分别为1.372 g/L和3306 U/mg，表明其能对PGA进行高效降解。 （3）重组果胶裂解酶应用于苎麻脱胶。在pH 8.5（Tris-HCl），50℃的条件下应用 rBvelPL1-Ec 进行苎麻脱胶，脱胶过程无 NaOH 添加，当rBvelPL1-Ec添加量为200 U，脱胶时间为4 h时，苎麻纤维中果胶含量仅剩1.06%，半纤维素含量降至14.41%，残胶率降至19.31%，纤维表面胶质明显减少，且纤维强力和白度均增强，验证了rBvelPL1-Ec对苎麻中果胶质具备优良的独立脱除能力。为了进一步脱除苎麻中的半纤维素等胶体，将酶与 0.25%（w/v）NaOH 联合脱胶，脱胶后苎麻的半纤维素含量降至3.09%，残胶率进一步降为6.82%；纤维的表面变得更为光滑，同时纤维强力与酶单独处理后的纤维强力相同（均高于生苎麻），且纤维白度得到进一步提升。酶处理、NaOH处理及酶-NaOH联合处理得到的苎麻失重率分别为21.16±0.69%、21.27±1.17%和30.47±0.46%，表明联合处理时有最好的脱胶效果，证明了rBvelPL1-Ec-NaOH联合脱胶法作为一个较为温和的生物化学脱胶工艺，在苎麻纤维脱胶领域有非常好的应用前景。
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