摘要
围产期奶牛乳腺组织泌乳能量需求提高而奶牛营养物质吸收量减少，导致能量负平衡（Negative energy balance,NEB），引发酮病。酮病奶牛血液中游离脂肪酸（Free fatty acids,FFA）含量明显升高。高浓度的FFA具有脂毒性，诱导奶牛乳腺上皮细胞产生大量活性氧（Reactive oxygen species,ROS），使乳腺组织处于氧化应激状态，造成乳腺损伤，并引起乳产量的下滑和乳品质的降低。自噬是真核生物细胞分解再重塑自身内部部分物质如受损细胞器、错误折叠蛋白及其他无法正常工作的细胞组分的一种高度保守的自我降解过程。转录因子EB（Transcription factor EB,TFEB）可促进溶酶体生物合成，促进自噬体成熟并与自噬溶酶体结合，从而调控自噬。有科学研究发现，番茄红素可缓解奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤以及改变氧化应激状态下动物机体的抗氧化酶活性及氧化终产物水平。且最近研究表明，番茄红素（Lycopene,LYC）具有增强细胞内自噬以维持细胞稳态的作用。因此，本研究旨在明确LYC对FFA致奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤保护作用及TFEB介导的自噬是否参与这一过程。 在体外培养奶牛乳腺上皮细胞系（MAC-T），采用不同浓度FFA诱导MAC-T细胞来模拟酮病奶牛乳腺组织的氧化应激状态。结果显示，与0 mM FFA处理组相比，0.3、0.6、1.2mMFFA处理后，细胞内ROS的含量逐渐升高，细胞凋亡率逐渐增加;细胞中自噬相关的LC3-Ⅱ、ATG5和TFEB蛋白水平逐渐降低，而P62蛋白水平逐渐增加，说明高浓度FFA可引起奶牛乳腺上皮细胞严重的氧化应激、凋亡，并抑制细胞自噬。使用1.2mMFFA刺激MAC-T细胞后再添加0、0.5、1、2 μM LYC处理的结果表明，随LYC添加浓度的增加，细胞内ROS的含量、细胞凋亡率和细胞内P62蛋白水平逐渐降低，LC3-Ⅱ、ATG5和TFEB蛋白水平逐渐升高，说明LYC可缓解FFA引起的奶牛乳腺上皮细胞的氧化应激、凋亡和自噬抑制。与BSA+DMSO组相比，FFA处理组细胞内ATG5、ATG7、TFEB的mRNA水平和LC3-Ⅱ、TFEB的蛋白水平明显降低，P62蛋白水平明显增加;然而添加LYC处理后，逆转了上述基因和蛋白的表达水平。此外，转染重组腺病毒MRFP-GFP-LC3 48 h,1.2 mM FFA处理24 h后添加2 μM LYC处理24小时，LC3黄色斑点（自噬小体）数量明显增多。以上说明LYC可能通过增强TFEB介导的自噬来缓解FFA造成的奶牛乳腺上皮细胞氧化应激、凋亡和自噬抑制。 通过转染TFEB过表达腺病毒探究TFEB介导的自噬在FFA诱导奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤中的作用;使用qRT-PCR法检验自噬相关基因ATG5、ATG7以及TFEB的mRNA表达水平，使用蛋白免疫印记检验电泳分离出的自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、P62、ATG5及TFEB的蛋白丰度，并按照试剂盒说明测量细胞内ROS的含量和细胞凋亡率以及细胞中过氧化氢酶（Catalase,CAT）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase,GSH-Px）活性。结果显示，过表达TFEB可降低FFA处理的细胞中P62的蛋白丰度，增加细胞内ATG5、ATG7、TFEB的mRNA水平和LC3-Ⅱ、ATG5和TFEB的蛋白丰度;同时TFEB介导的自噬减弱了外源性FFA诱导的奶牛乳腺上皮细胞内抗氧化物酶CAT、SOD、GSH-Px的活性的降低和ROS含量、细胞凋亡率的增加。为探究TFEB介导的自噬对奶牛乳腺上皮细胞氧化应激和凋亡的调节机制，在奶牛乳腺上皮细胞中添加自噬抑制剂氯喹（Chloroquine diphosphate,CQ），结果显示，CQ处理使细胞内哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mechanistic target ofrapamycin,mTOR）和TFEB蛋白丰度降低,p-mTOR的蛋白丰度和p-mTOR/mTOR比值增加，细胞内ROS含量和细胞凋亡率增加。表明CQ通过激活mTOR信号通路来抑制TFEB介导的自噬，进而降低LYC对FFA诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化应激和凋亡的保护作用。 为验证TFEB介导的自噬对FFA致奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤的调节作用，在MAC-T细胞中转染TFEB小干扰RNA，结果发现，沉默TFEB后促凋亡相关蛋白caspase3、caspase9和Bax的蛋白丰度增加，细胞内ROS的含量和细胞凋亡率增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白丰度降低。表明沉默TFEB降低了 LYC对FFA诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化应激和凋亡的保护作用。 以上结果表明，外源性FFA刺激造成奶牛乳腺上皮细胞氧化应激和凋亡，并抑制自噬，LYC处理可缓解FFA对奶牛乳腺上皮细胞的氧化应激、凋亡和自噬抑制。过表达TFEB可显著增加抗氧化物酶活性并缓解FFA对奶牛乳腺上皮细胞的氧化应激和凋亡。CQ通过激活mTOR信号通路抑制TFEB介导的自噬，进而降低LYC对FFA诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化应激和凋亡的保护作用，沉默TFEB也降低了 LYC的保护作用。综上可知LYC通过增强TFEB介导的自噬从而缓解FFA诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤和凋亡。本研究结果为筛选酮病奶牛乳腺组织氧化损伤的治疗药物及分子靶点提供新的理论依据。
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