摘要
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)是一种非常规酵母，具有独特的生理和代谢优势，是一种极具潜力的真核微生物细胞工厂。合成生物学元件的开发和应用极大地提高了细胞工厂构建的灵活性。其中，启动子元件是合成生物学和代谢工程中基因表达调控的基础。但是，目前缺乏针对解脂耶氏酵母中天然启动子的系统研究，并且可供选择的启动子种类十分有限，特别是通用型动态调控启动子尚无报道。因此，深入挖掘解脂耶氏酵母内源的启动子元件，扩展合成生物学工具包成为亟须解决的问题。 本课题首先对不同培养条件和生长阶段的解脂耶氏酵母野生菌株 Po1f进行转录组分析，根据转录水平上的基因表达强度和趋势，选取不同的天然启动子作为候选，以hrGFP(人源化绿色荧光蛋白)作为报告蛋白，针对候选启动子分别进行表征，筛选得到了一系列生长调节型启动子和梯度强度型启动子。其中，34个具有时序性动态调控作用的启动子随培养时间会呈现上调或下调趋势，这是首次在解脂耶氏酵母中获得通用的生长调节型启动子，可作为解脂耶氏酵母动态调控策略宝贵的工具盒;61个梯度强度型启动子中，表达最强和表达最弱的启动子间的荧光倍数变化达到93.40倍。此外，有3个启动子的表达强度分别为目前报道的强启动子PTEFin的1.10倍、1.48倍和1.69倍。通过精细截短鉴定获得了非常规酵母启动子的潜在上游激活序列(UAS)，可用于合成新型人工启动子。 以上启动子元件将有利于解脂耶氏酵母精确调控基因表达，为高效细胞工厂的构建提供必要工具。本课题以重要平台化学品3-羟基丙酸(3-Hydroxypropionic acid,3-HP)的生物合成为例，将筛选到的启动子应用于解脂耶氏酵母中3-HP生物合成途径的模块化构建，包括组合不同强度的启动子以平衡MCR-C*与MCR-N的基因表达量、应用动态下调型启动子调控FAS1基因以弱化竞争途径、应用强启动子表达上游基因增强前体供应等多种代谢策略。最终获得的酵母工程菌株H6-4经72 h摇瓶发酵可以积累11.42 g/L的3-HP。分批补料发酵中，3-HP产量、转化率和生产速率分别达到100.37 g/L、0.21 g/g、0.48 g/L/h。这是目前为止已报道酵母发酵生产3-HP的最高产量。这些结果证明了上述不同调控类型的启动子元件在解脂耶氏酵母代谢工程中的应用潜力。 综上，本结果丰富了解脂耶氏酵母的启动子元件库，从多角度实现了基因表达水平的精确调控，同时为动态调控代谢网络和构建高效细胞工厂提供了参考，也为3-HP高效生物合成打下了扎实的基础。
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