摘要
背景和目的:植体周炎是种植牙失败的最常见原因，但目前其发病机制尚未完全阐明。课题组前期对植体周炎组织、牙周炎组织和正常牙龈组织进行全转录组测序，发现植体周炎与牙周炎和正常牙龈的差异表达基因均显著富集在对金属离子的反应和先天免疫反应的通路和过程，并发现多个差异表达miRNA与mRNA可能存在靶向关系参与植体周炎的调控。在以往的研究中，许多学者证实植体周有钛颗粒存在，并认为这些钛颗粒可作为异物使宿主发生免疫反应在植体周炎的发生发展中起到重要作用。因此，我们推测这些差异表达miRNA和mRNA可能与植体周钛颗粒的存在有关。另外，由于口腔是一个有菌环境，钛颗粒和微生物免疫反应相互混杂，钛颗粒与微生物在植体周炎发病机制中存在怎样的关系仍不清楚。因此，继续深入研究钛颗粒在植体周炎中的作用，探讨测序发现的差异表达miRNA与mRNA是否与种植体周钛颗粒有关，对揭示植体周炎的发生机制具有重要意义。 方法:1.收集临床健康植体周组织和植体周炎组织，通过RT-PCR检测组织中 miR-9-5p、SIRT1、FAM126B、miR-196a-5p、YOD1 的表达水平，对前期测序分析发现的差异表达miRNA和mRNA进行验证，并进行Pearson相关性分析。 2.建立埋入式愈合大鼠种植模型，使用LPS模拟细菌的作用，在种植体颈部分别进行PBS、钛颗粒、LPS、钛颗粒+LPS四种干预。观察钛颗粒在植体周炎中的作用及其与LPS的关系，并探讨钛颗粒是否通过影响miRNA和mRNA差异表达进而影响植体周炎的发生。Micro-CT检测种植体周骨高度变化;HE染色观察种植体周组织形态和细胞形态;双重免疫荧光检测组织中巨噬细胞浸润及表型特点;IHC检测组织中炎性因子的表达情况;RT-PCR检测种植体周组织中炎症因子及miR-9-5p、SIRT1基因的表达情况。 3.通过细胞实验对相关机制进行探讨。研究设空白对照组（control），钛颗粒（Ti）组，LPS组和LPS+Ti组共4组，观察钛颗粒在有/无LPS的条件下对RAW264.7巨噬细胞极化的影响及对miR-9-5p和SIRT1的影响。然后使用脂质体瞬时转染法，敲低/过表达miR-9-5p,进一步探讨巨噬细胞极化的作用机制。流式细胞术检测M1和M2型巨噬细胞标志物的表达情况;RT-PCR 检测细胞中 miR-9-5p、SIRT1 以及 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10基因的表达;ELISA检测细胞培养基上清液中IL-lβ、IL-6、TNF-a、IL-10的表达;Western blot检测SIRT1和NF-κB通路蛋白的表达。 结果:1.与健康组比较，植体周炎组miR-9-5p的表达显著升高（P＜0.001）,SIRT1的表达显著降低（P＜0.001），两者为负相关关系。FAM126B、miR-196a-5p、YOD1在两组样本中的表达无明显差别（P＞0.05）。 2.在埋入式愈合大鼠种植模型进行PBS、钛颗粒、LPS、钛颗粒+LPS四种干预，结果显示:（1）单纯的钛颗粒对植体周骨高度无影响，LPS组和Ti+LPS骨高度降低，Ti+LPS组降低最明显。（2）组织学观察见钛颗粒组结缔组织炎症细胞灶性浸润;LPS组软硬组织连接处纤维组织增生，毛细血管增生，结缔组织内可见淋巴细胞散在浸润;Ti+LPS组结缔组织中纤维细胞数量明显增加;结缔组织中有较多的淋巴细胞散在浸润，局部组织灶性坏死伴炎症细胞浸润，毛细血管增生明显。（3）炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-a在各组间的表达趋势一致，即钛颗粒组与PBS组无明显差别，LPS与和Ti+LPS组表达增高，Ti+LPS组增高最明显。（4）免疫荧光双标染色结果显示，PBS组巨噬细胞的表达主要集中在种植体颈部软组织与骨组织交接的软组织内，而Ti组、LPS组和Ti+LPS组巨噬细胞的表达主要集中在种植体周骨吸收区与种植体界面之间的三角内。Ti+LPS组巨噬细胞浸润范围最大。巨噬细胞局部表达密度PBS组（25.56％）和Ti组无差别（26.13％），LPS 组（37.02％）和 Ti+LPS 组（48.13％）巨噬细胞浸润更明显，且均以M1型为主。（5）RT-PCR结果显示:①miR-9-5p在各组的表达:PBS组＜Ti组＜LPS组＜Ti+LPS组;除PBS组与Ti组间差异无统计学意义外，其余各组间差异均有统计学意义（P＜0.05）;②SIRT1 mRNA在各组的表达:与PBS组比较，Ti组表达无明显变化;与PBS组和Ti组相比，LPS组表达降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）;Ti+LPS组表达量最低，与其它3组差异均具有统计学意义（P＜0.05）。 3.体外细胞实验结果显示:（1）当钛颗粒浓度≤150 μg/mL时，无论有/无LPS存在，钛颗粒对巨噬细胞活性无影响。（2）4组干预方式对巨噬细胞极化的影响:流式细胞术、RT-PCR和ELISA对M1型巨噬细胞标志物的检测结果呈现相同的趋势，即与对照组比较，Ti组无显著差异，LPS和LPS+Ti均显著增加，LPS+Ti增加最明显。M2型巨噬细胞标志物IL-10的RT-PCR和ELISA检测结果一致，即与对照组比较，Ti组无显著差异，LPS组和Ti+LPS组均降低，Ti+LPS组降低最明显;而流式细胞术结果显示除LPS组CD206+细胞数显著增加外，其它三组间无显著差异。（3）4组干预对miR-9-5p和SIRT1的影响:miR-9-5p在Ti组和对照组表达无明显差别，LPS和LPS+Ti均显著增加，LPS+Ti增加最明显，并与M1型表面标志物的表达呈现相同的趋势。SIRT1 mRNA在Ti组的表达与对照组无明显差别，LPS组表达较对照组和Ti组明显降低，LPS+Ti组降低最明显。各组SIRT1蛋白的表达与mRNA的表达趋势一致。（4）过表达miR-9-5p，细胞内SIRT1的表达显著降低，巨噬细胞CD86+表达增加，CD206+表达降低;敲低miR-9-5p后，SIRT1的表达显著增加，巨噬细胞CD86+表达降低，CD206+表达增加。（5）过表达 miR-9-5p，乙酰化 NF-κB P65（Lys310）的表达增加;敲低miR-9-5p后，乙酰化NF-κB P65（Lys310）表达降低。 结论:1.单纯钛颗粒（0.5 mg,干预4周）不会引起植体周明显的炎症反应和骨吸收。钛颗粒与LPS共同作用时，钛颗粒可协同LPS的作用，引起植体周更严重的炎症反应和骨吸收。 2.单纯钛颗粒不影响巨噬细胞极化;钛颗粒与LPS共同作用时，巨噬细胞表现出更明显的M1型极化特性。 3.单纯钛颗粒不引起植体周组织和巨噬细胞中miR-9-5p和SIRT1的表达变化。 4.在LPS存在的条件下，钛颗粒以协同方式上调miR-9-5p靶向SIRT1调控NF-κB信号通路促进巨噬细胞M1型极化。 综上，植体周单纯的钛颗粒是安全的（0.5 mg,干预4周），miR-9-5p/SIRT1可能在植体周炎的发生过程中起到了关键性调控作用，植体周钛颗粒协同LPS可能通过上调miR-9-5p靶向抑制SIRT1激活NF-κB信号通路促进巨噬细胞M1型极化参与植体周炎的发生。
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