摘要
背景： 胰腺癌是消化道肿瘤中恶性程度最高的肿瘤之一，早期发病症状极不明显，且缺乏肿瘤标志物，往往进展到晚期或者发生远处转移后才被发现，具有进展快、死亡率高的特点。越来越多的研究发现胰腺癌与肥胖、吸烟、饮酒、高油高脂饮食、糖尿病和遗传等因素有关。目前胰腺癌的治疗方式受限，大多数患者明确诊断时已失去手术时机，以手术切除为根治目的的治疗并不能使患者获得较大受益，因此患者生存期比较短，5年生存率仅为6％。 铜死亡（Cuproptosis）与其他的已知的细胞死亡途径不同，是最近发现的一种铜诱导的细胞死亡形式，细胞内过量的二价铜离子（Cu2+）与线粒体三羧酸循环中的脂酰化成分结合，导致这些脂酰化蛋白质的聚集，干扰正常的线粒体呼吸链，诱导蛋白质应激，导致细胞死亡。beta-拉帕醌（β-Lap/Lap）可以通过NAD（P）H醌氧化还原酶-1（NQO-1）介导的生物还原反应进一步提高肿瘤细胞中活性氧（ROS）水平，随后引起氧化性DNA损伤，最终导致细胞程序性死亡;同时过氧化氢（H2O2）水平的升高为化学动力学治疗（CDT）提供了有力保障。 此外Cu2+可消耗肿瘤部位过表达的谷胱甘肽（GSH），生成一价亚铜离子（Cu+），可与肿瘤微环境中的H2O2发生类芬顿反应，产生高毒性羟基自由基（·OH），诱导 CDT。 基于此，我们开发了基于一种铜离子-单宁酸共组装纳米片装载Lap（Cu-TA@Lap）的纳米药物，通过铜死亡与CDT协同胰腺癌的免疫原性死亡（ICD）。 目的： 探讨pH及GSH响应型纳米药物诱导小鼠胰腺癌细胞（Pan 02）铜死亡并逆转免疫抑制性肿瘤微环境的相关机制。 方法： 1.合成负载Lap的铜单宁酸（Cu-TA）纳米药物（Cu-TA@Lap），检测该纳米颗粒在水溶液中的粒径及电位大小，检测其在磷酸盐缓冲盐水（PBS）、水、含胎牛血清DMEM溶液中粒径大小随时间变化。通过透射电镜观察纳米药物形状。 2.通过倒置荧光显微镜和流式细胞仪检测Pan 02细胞在不同时刻对纳米药物的摄取情况。通过亚甲蓝（MB）的降解检测纳米药物生成·OH的能力。并通过倒置荧光显微镜及流式细胞仪检测细胞内ROS的生成情况。通过GSH检测试剂盒检测纳米药物在细胞内、细胞外的GSH消耗能力。 3.用活死染色法、MTT法、结晶紫染色法检测纳米药物对Pan 02细胞的杀伤效果。用凋亡试剂盒分析纳米药物对Pan 02细胞凋亡的情况。用免疫印迹试验（Western Blot）检测Pan 02细胞铜死亡相关通路蛋白的表达。通过酶联免疫吸附测定（ELISA）、流式细胞术等检测损伤相关分子模式（DAMPs），评价纳米药物诱导的ICD。 4.不同药物处理过的Pan 02细胞与小鼠树突状细胞（DC）共培养，通过流式细胞术检测DC细胞的成熟。 5.构建小鼠皮下瘤模型。通过尾静脉注射给药，用于体内免疫激活、体内抗肿瘤效果和联合α-PD-L1实验。体内免疫激活:Pan 02荷瘤小鼠末次给药5天后解剖小鼠，提取肿瘤及其引流淋巴结、脾脏细胞，荧光抗体染色后流式细胞仪检测免疫细胞活化情况。体内抗肿瘤效果:记录小鼠体重与肿瘤大小，首次给药后第18天处死老鼠，提取肿瘤及其引流淋巴结、脾脏细胞，荧光抗体染色后流式细胞仪检测免疫细胞活化情况。并通过小鼠主要器官（心脏、脾脏、肝脏、肾脏、肺）苏木精伊红（HE）染色评价纳米药物生物安全性。另外一个平行试验中，纳米药物联合α-PD-L1,观察荷瘤小鼠体重及肿瘤变化。 结果： 1.通过动态光散射仪（DLS）测得Cu-TA@Lap纳米药物的粒径约为254 nm,呈负电位，且具有良好的分散系数。该纳米粒子在PBS、水及含胎牛血清的DMEM三种溶液中具有较好的稳定性，72小时内粒径大小及分散系数未发生明显变化。 2.在相同浓度H2O2存在的条件下，全波谱分析结果显示Cu-TA处理降解了更多的MB，表明产生了更多的·OH，且具有Cu-TA浓度依赖性。在GSH浓度相同的条件下，不同药物处理48小时后，酶标仪检测GSH吸光度显示Cu-TA@Lap处理具有最强的GSH耗竭能力，且随着Cu-TA浓度的增加GSH的消耗呈上升的趋势。 倒置荧光显微镜结果显示，相同浓度氯化铜（CuCl2）与Cu-TA处理Pan 02细胞后，随着时间的推移，纳米药物表现出较好的摄取能力。不同药物处理Pan 02细胞后，倒置荧光显微镜图像显示Cu-TA@Lap组在细胞内观察到较强的绿色荧光信号，说明ROS的大量产生，流式细胞术同样验证了这一结果。不同药物处理Pan 02细胞后，Cu-TA@Lap组在细胞内检测到较低的GSH水平。 3.不同药物处理Pan 02细胞后，活死细胞染色、MTT及结晶紫染色均显示Cu-TA@Lap具有较强的细胞杀伤能力。流式细胞术结果显示Cu-TA@Lap可以明显促进Pan 02细胞凋亡。通过检测DAMPs的释放，该纳米药物表现出较强的促进Pan 02细胞发生ICD的能力。Western Blot结果显示Cu-TA@Lap有效促进了 Pan 02细胞发生铜死亡。 4.通过Transwell仪器使不同药物预处理的Pan 02细胞与DC细胞共培养48 h,流式细胞术检测结果显示Cu-TA@Lap预处理组有效促进DC细胞的成熟。 5.相同时间内Cu-TA@Lap处理组小鼠肿瘤生长受到明显抑制，流式细胞术结果显示Cu-TA@Lap处理组小鼠肿瘤、脾脏内CD8+T细胞百分比最高，且CD8+T细胞的增殖能力（CD8+T细胞中Ki67阳性率）和IFN-γ分泌能力（CD8+T细胞中IFN-γ阳性率）也远高于其他处理组，且M2型巨噬细胞（F4/80+、CD206+）比例明显低于其他组。此外，流式细胞术结果进一步表明Cu-TA@Lap治疗有效降低了免疫抑制性调节性T细胞的百分比（CD3+、CD4+、Foxp-3+）。Cu-TA@Lap处理组肿瘤引流淋巴结中成熟DC细胞（CD40+、CD80+、CD86+）比例也明显高于其他组。Cu-TA@Lap联合α-PD-L1治疗后可观察到更有效的抑瘤效果。尾静脉注射纳米药物后小鼠主要器官HE染色结果未见明显损伤，且治疗期间小鼠体重、行为、饮食等无明显异常变化。 结论： 合成了负载Lap的Cu-TA纳米药物（Cu-TA@Lap），纳米药物通过增强渗透滞留效应（EPR）富集在肿瘤部位，通过铜死亡诱导蛋白应激激活Lap,放大诱导肿瘤细胞内类芬顿反应，诱导CDT，然后铜死亡协同CDT诱导ICD，提高胰腺癌免疫治疗。
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