摘要
目的和意义:马尔尼菲篮状菌病是由马尔尼菲篮状菌（Talaromyces marneffei,T. marneffei）感染引起的全身侵袭性真菌病，在东南亚和中国南部地区广泛流行，主要感染免疫功能低下人群。T. marneffei在宿主体内的免疫逃逸可能是其持续感染且致死率高的关键环节,但具体机制尚未明确。本研究旨在探究T. marneffei发生潜伏性感染以及免疫逃逸的分子机制，评价免疫检查点抑制处理对真菌的清除效果，为开展以免疫逃逸信号阻断为靶点的T. marneffei防治提供新思路。 方法:（1） T. marneffei感染小鼠肝组织基因表达谱的RNA-seq分析:收集T. marneffei感染小鼠肝组织，进行RNA-seq分析，筛选不同感染时间点中的关键靶基因;使用GOSemSim包对关键基因进行语义相似度分析，获取hub基因排序，明确与T. marneffei感染相关的关键基因。 （2）在人群、动物和细胞水平探索T. marneffei感染与PD-L1的关联:收集健康人群、HIV以及HIV / T. marneffei感染人群的外周血单个核细胞（ Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs），检测各组 PBMCs 不同细胞亚群中PD-1和PD-L1的表达水平，探究HIV感染和T. marneffei进展与PD-L1的关联。随后，构建T. marneffei感染动物模型，采用流式细胞术、RT-qPCR和WB等技术检测肝脾组织不同细胞亚群中PD-1、PD-L1以及炎症相关因子的表达水平。同时，构建kupffer细胞感染模型，检测T. marneffei感染和β-葡聚糖处理前后kupffer细胞中PD-L1的变化差异。 （3）PD-L1在T. marneffei感染及其免疫逃逸中的机制研究:使用PD-L1抑制剂分别处理T. marneffei感染的小鼠和kupffer - CTLL-2细胞共培养体系，比较PD-L1抑制剂处理前后肝脾组织及kupffer细胞中的真菌负荷。随后，分别阻断PD-L1的上游调控通路，检测T. marneffei和β-葡聚糖感染的kupffer细胞中PD-L1变化水平，明确T. marneffei调控PD-L1过程中的关键信号通路。最后，构建T. marneffei感染kupffer- CTLL-2细胞共培养体系模型，并使用CFSE示踪荧光探针标记CTLL-2细胞，观察PD-L1抑制剂处理前后CTLL-2细胞平均荧光强度和细胞增殖数;采用RNA-seq技术筛选CTLL-2细胞中的差异表达基因及关键调控通路;通过RT-qPCR和WB等技术检测 kupffer 和 CTLL-2 细胞中 PD-1、PD-L1、SHP-2、p-SHP-2 以及炎症因子的变化水平，探究PD-L1抑制剂处理对T细胞功能的促进作用。 结果:（1 ）T.marneffei感染小鼠肝组织RNA-seq分析表明，T. marneffei感染后，差异基因主要富集在感染性疾病、炎症因子等通路。在所有hub基因中，Cd274 （PD-L1）排名最高，中位数为 0.60 （IQR:0.50- 0.69），Cd274在感染后3个时间点的表达持续升高，倍数从13.66上调至49.56倍。 （2）检测 HIV 和 HIV / T. marneffei 感染患者 PBMCs 中的 PD-1、PD-L1表达水平。在CD4细胞中，HIV / T.marneffei组与HIV组PD-1的表达比例分别为 43.85 ± 17.86 和 28.83 ±9.95，PD-L1 为 13.64 ±7.48 和 9.19 ±6.33;在CD8细胞中，两组患者PD-1的表达比例分别是41.37± 11.99和35.47±11.40,PD-L1 为 16.35 ± 11.54 和 8.76±6.55。与 HIV 组相比，HIV / T. marneffei组CD4、CD8细胞中的PD-1、PD-L1表达水平均升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。 （3）建立T. marneffei感染动物模型。T. marneffei感染7 d后，肝脏CD4 细胞中 PD-1 比例从 3.15 ± 1.02 升至 9.83 ±3.98，PD-L1 从 1.00 ± 0.32升至 16.21 ± 1.10 （P＜0.05）;脾脏 CD4 细胞 PD-1 从 1.82±0.17 升至 4.17± 0.65,PD-L1 从 1.13 ±0.29 升至 10.21 ±7.08,表达水平均升高（P ＜0.05）。此外，肝脾组织CD8细胞中PD-1和PD-L1的表达比例也表现出上调趋势，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。 （4）分别使用PD-L1抑制剂及同型对照处理受感染的小鼠，对照组及PD-L1抑制剂处理组肝组织真菌载量分别为2587981 ± 400202 CFU和251844 ± 99655 CFU,PD-L1抑制剂处理下调了 90.27％的真菌负荷（P＜0.05）;脾组织真菌载量分别为 240277 ± 48392 CFU 和 75968 ± 15722 CFU,抑制剂处理后真菌负荷下降了 68.38％ （P＜ 0.05）。在免疫抑制小鼠模型中，PD-L1抑制剂处理同样降低了肝脾组织中的真菌负荷（P＜0.05）。 （5）使用PD-L1抑制剂及同型对照处理kupffer- CTLL-2细胞共培养体系，T. marneffei感染24 h后，对照组及PD-L1抑制剂处理组kupffer细胞中的真菌载量分别为280000 ± 36515 CFU和140000 ± 11547 CFU,与对照组相比，真菌负荷下降了 50.00％,感染48 h后真菌负荷为340000 ± 100000 CFU和150000 ± 19149 CFU,下降了 55.88％,差异均有统计学意义（P＜0.05）。 （6）使用PD-L1抑制剂及同型对照处理受感染的kupffer - CTLL-2细胞共培养体系，对照组及PD-L1抑制剂处理组CTLL-2细胞平均荧光强度分别为4.74± 0.09 （× 105）和4.59 ± 0.06 （× 105），与对照组相比强度降低了 3.19％ （P＜ 0.05）;CTLL-2 细胞数分别为 8020 ± 25 和 8215 ±57，增殖水平上调了 2.43％,差异有统计学意义（P＜0.05）。另外，PD-L1抑制剂处理组CTLL-2细胞中PD-1、SHP-2和p-SHP-2表达水平均下调（P＜ 0.05），T细胞受体信号通路激活。 （7）分别使用MAPK、NF-κB、PI3K等通路抑制剂处理kupffer细胞。各抑制剂对T. marneffei上调的PD-L1均有抑制作用，但PI3K抑制剂处理的抑制效果最大，与T. marneffei感染组相比，PI3K抑制剂组的PD-L1下降了 61.31％ （P＜0.05）。另外，PI3K抑制剂处理也降低了由β-葡聚糖刺激引起的PD-L1上调（P＜0.05）。 结论:在T. marneffei感染的显著表达基因中，PD-L1表现出与其它基因高度关联的特征，是关键的调控因子。T. marneffei感染上调HIV / T.marneffei患者PD-1和PD-L1水平，同时上调免疫正常和免疫缺陷小鼠PD-1、PD-L1及炎症因子的表达。PD-L1抑制剂处理可有效下调小鼠和kupffer细胞中的T. marneffei真菌负荷，同时抑制T细胞p-SHP-2表达，激活T细胞受体信号通路，提高细胞活力和增殖水平。此外，PI3K信号通路可能参与了 T. marneffei对PD-L1的调控过程，导致PD-L1表达水平上调，这可能是T. marneffei在机体发生免疫逃逸的重要原因。
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