摘要
1背景与目的 食管癌是全球死亡率最高的六大恶性肿瘤之一，其主要组织类型分为食管鳞状细胞癌和食管腺癌两大类，中国人食管癌组织类型以食管鳞癌为主，占97％。现行的食管癌分期标准多基于TNM分期系统，但仍有部分早期食管癌病人预后很差，这种矛盾的现象应当引起医学界的关注。在本实验室先行研究的基础上,已对早期食管鳞状细胞癌的生存预后影响因素进行了深入探讨。该研究揭示了性别、年龄、肿瘤的长径、表型及其浸润程度等因素对患者生存预后具有显著影响，其中脉管癌栓阳性被认为是影响预后的关键因素，患者面临着更高的潜在复发与死亡风险。然而，目前关于影响食管鳞癌患者脉管癌栓形成的危险因素及其与临床病理特征的关联，尚未得到完全阐明。 本研究旨在进一步探索脉管癌栓对食管鳞癌患者生存预后的影响，并识别与脉管癌栓形成相关的临床病理特征及免疫标志物，进一步深入了解脉管癌栓阳性与阴性的基因突变频率差异。本研究目的在于为食管鳞癌患者提供更精确的预后评估，提升患者的生存率及生活质量，以期实现食管鳞癌的精准防治。 2材料与方法 2.1食管鳞癌临床病理特征和生存分析及免疫组化蛋白表达 2.1.1研究对象 本研究共纳入4458例食管鳞癌患者，来自郑州大学第一附属医院省部共建食管癌防治国家重点实验室建立的食管癌临床诊疗和随访信息数据库和样本库。纳入标准:（1）经病理确诊为原发恶性肿瘤;（2）行肿瘤根治术治疗;（3）主要临床病理信息完整;（4）病理诊断中有癌栓记录。所有患者术前均签署相关研究知情同意书，该研究获郑州大学伦理委员会批准。 2.1.2研究方法 收集录入并核实食管癌患者的临床病理信息，对参与研究的患者进行定期随访，并整理录入其随访信息。采用SPSS26.0软件对收集的数据进行处理，运用Kaplan-Meier单因素分析影响患者生存因素。通过COX模型进行多因素分析，探讨影响患者生存的独立因素。利用卡方检验分析脉管癌栓与临床病理特征的关系。通过Logistic回归分析影响脉管癌栓形成的危险因素。卡方检验比较免疫蛋白在脉管癌栓阳性与阴性患者中阳性率的表达差异。P＜0.05为差异有统计学意义。 2.2食管鳞癌脉管癌栓阳性和阴性的高频基因突变对比 2.2.1研究对象 本研究中共有199例食管鳞癌患者被随机纳入。患者的入选和排除标准为: （1）均接受食管癌根治术治疗;（2）术后组织病理学诊断为食管鳞癌，不合并其他恶性肿瘤，患者术前未接受任何放疗、化疗或放化疗等治疗;（3）患者一般信息（性别、年龄、家庭住址、联系方式）和组织病理学信息、治疗信息齐全。 2.2.2研究方法 共收集来自高发地区医院的199位食管癌患者的癌组织和癌旁组织。所用组织样品均为新鲜组织样本，在手术切除后30分钟内剥离，并在-80℃保存。癌旁正常组织选取距肿瘤边缘至少2厘米远的邻近上皮正常组织。 使用DNA提取试剂盒提取食管鳞癌组织和对应癌旁组织的DNA,按照试剂盒说明书进行。采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA降解程度、RNA或蛋白污染，以及杂带情况，并使用Qubit 2.0检测DNA浓度，合格标准为DNA浓度≥20 ng/μl,总量≥0.6μg。使用Covaris破碎仪将DNA打断成180-280bp片段，并使用Agilent SureSelect Human All Exon V5/V6试剂盒进行捕获，接下来进行末端修复、磷酸化、加A尾、连接接头、探针杂交和PCR线性扩增。文库建立步骤包括:Qubit 2.0初步定量、Agilent 2100检测文库Insert size和qPCR法准确定量文库有效浓度。上机测序在HiSeq4000平台上进行，采用IlluminaHiSeq PE150测序。测序数据质量评估，包括测序错误率、数据量和比对率，过滤低质量数据，确保Q30≥80％。测序深度和覆盖度通过BWA与参考基因组比对获得。最后，进行体细胞变异检测，包括使用MuTect算法检测单核苷酸变异（SNV）和Strelka软件检测小片段插入或缺失（ InDel），高频突变基因则使用MuSiC软件检测。 3结果 3.1食管鳞癌患者的临床病理特征分布: 4458例食管鳞癌患者中，包含1305例脉管癌栓阳性患者，3153例脉管癌栓阴性患者。脉管癌栓阳性与阴性两组患者在淋巴结转移、性别、年龄、高低发区、饮酒史、肿瘤部位、分化程度和T分期组间分布差异具有统计学意义;在吸烟史、家族史组间分布差异无统计学意义。 3.2食管鳞癌患者预后的影响因素 Kaplan-Meier单因素分析结果表明:脉管癌栓、性别、年龄、淋巴结转移、T分期是食管鳞癌患者预后影响因素;肿瘤部位、家族史、高低发区、吸烟史、饮酒史不是食管鳞癌患者预后影响因素。 将脉管癌栓、性别、年龄等5种临床表型纳入多因素Cox回归分析，结果表明:脉管癌栓、性别、年龄、淋巴结转移、T分期均为食管鳞癌患者预后的独立危险因素。 3.3脉管癌栓对食管鳞癌患者预后影响的增强效应 4458例食管鳞癌患者中，包含1305例脉管癌栓阳性患者，3153例脉管癌栓阴性患者。以脉管癌栓阴性合并淋巴结转移阴性组为参照时，脉管癌栓阳性合并淋巴结转移阳性患者死亡风险是参照组的2.934倍（95％CI:2.460-3.499,P＜0.001）,淋巴结转移阳性合并脉管癌栓阴性患者死亡风险是参照组的2.374倍（95％CI:1.983-2.842,P＜0.001），脉管癌栓阳性合并淋巴结转移阴性组患者的死亡风险是参照组的 2.139 倍（95％CI:1.678-2.727,P＜0.001）。 3.4食管鳞癌患者发生脉管癌栓的危险因素 将淋巴结转移、性别、年龄、高低发区、饮酒史、肿瘤部位、分化程度和T分期纳入Logistic回归，结果表明性别、年龄、T分期、N分期是食管鳞癌患者脉管癌栓的独立危险因素。 3.5脉管癌栓阳性与D2-40、Her-2和P16蛋白阳性表达关系 脉管癌栓阳性患者的D2-40、Her-2和P16阳性表达率高于脉管阴性患者。D2-40、Her-2和P16三种免疫蛋白的阳性率与脉管癌栓阳性率的组间分布差异具有统计学意义。 3.6 199例食管鳞癌患者脉管癌栓阳性组和阴性组基因突变特征分析 199例患者的平均年龄为60.6±7.8岁，男性与女性比例为2.1∶1。整体突变频率排在前十位的基因为 TP53 （83％）、TTN （38％）、NOTCH1 （23％）、MUC16（23％）、KMT2D （22％）、PER3 （17％）、SYNE1（16％）、CSMD3 （15％）、CDKN2A（14％）和 RYR2 （13％）。 在脉管癌栓阳性组中，突变频率较高的基因为TP53 （86％）、TTN （44％）、NOTCH1 （25％）、MUC16（21％）、KMT2D（18％）、PER3（17％）、MUC4 （16％）、PCLO （16％）、SYNE1 （16％）和CDKN2A（7％）。 在脉管癌栓阴性组中，突变频率较高的基因为TP53 （80％）、TTN （34％）、KMT2D （25％）、MUC16 （24％）、NOTCH1 （21％）、CDKN2A （17％）、CSMD3（16％）、SYNE1 （16％）、ZFHX4 （16％）和 PER3 （15％）。 卡方检验结果显示，CDKN2A基因突变频率在脉管癌栓阳性组和阴性组间差异具有统计学意义（x2=5.568，P=0.018）。 4结论 （1）脉管癌栓是食管鳞癌患者总生存时间的独立预后指标。 （2） 性别、年龄、T分期、N分期是脉管癌栓的独立危险因素。 （3） D2-40可标记脉管癌栓，P16和HER-2高表达与脉管癌栓形成相关。 （4） 脉管癌栓阴性组的CDKN2A突变频率显著高于阳性组。
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