摘要
研究目的： 1.建立CKD肌少症SD大鼠模型，通过体内外实验，观察JJHS对该模型大鼠肾脏和骨骼肌结构和功能、AMPK/PGC-1α通路相关分子表达水平、尿毒症毒素水平和线粒体能量代谢相关指标的影响。 2.通过鉴定加JJHS的有效成分，筛选该方主要活性成分，并靶向深入研究JJHS对CKD肌少症的治疗作用。 3.基于体内实验研究结果及该方成分鉴定结果，探究JJHS有效成分对延缓IS诱导C2C12细胞损伤及能量代谢下降的可能机制。 研究方法： 1.动物实验 2.细胞实验 研究结果： 1.动物实验 （1） JJHS对大鼠体重和骨骼肌的影响 体重:实验第16周（术后第12周）时，CKD的大鼠体重显著低于假手术组（ Sham）组（P＜0.001）。与模型组相比，中药JJHS-L组和JJHS-H组的大鼠较CKD组体重有所增加（P＜0.05）。 骨骼肌:胫骨前肌（Tibialis anterior，TA）、比目鱼肌（Soleus,SO）和腓肠肌（Gastrocnemius，GA）骨骼肌肉的体积在JJHS高低浓度治疗组中均显著大于CKD组。与Sham组相比，CKD组TA、SO和GA肌肉重量/胫骨长度均显著减少（P＜0.01），经JJHS治疗，TA、SO和GA肌肉重量/胫骨长度均有显著改善（P＜0.01）。 （2） JJHS对大鼠肝肾功能的影响 肝功能:在Sham组和Sham+JJHS组之间，ALT和AST水平无统计学差异（P＞0.05）,表明中药JJHS没有肝肾毒性。 肾功能:与Sham组相比，CKD组血清SCr、BUN和24 h-UTP水平显著增高（P＜0.01;P＜0.001;P＜0.001 ）。JJHS 可显著改善 SCr、BUN 和 24 h-UTP 水平（P＜0.05）,其中以JJHS-H组最明显。 （3） JJHS对CKD大鼠肾脏病理学改变的影响 H&E染色:CKD组中观察到肾小球硬化、间质水肿、纤维化和明显炎症细胞浸润、肾小管萎缩。JJHS治疗组显著改善了 5/6Nx手术引起的炎症反应和病理损伤。 Masson''s染色:CKD纤维化评分明显高于Sham组（P＜0.001 ）;与CKD组相比，JJHS-L和JJHS-H组纤维化评分明显降低（P＜0.01）。 （4） JJHS对CKD大鼠骨骼肌组织病理学改变的影响 H&E染色:与Sham组相比，5/6 Nx大鼠的GA肌纤维排列紊乱，炎性细胞浸润增多，GA肌纤维横截面积明显减小（P＜0.001）。与CKD组相比，JJHS-L和JJHS-H组组可见肌纤维排列较规则，炎细胞浸润减少，GA肌纤维横截面积减小明显改善（P＜0.01;P＜0.001）。此外，通过TA和SO组织进行了H&E染色，呈现出与GA相一致的结果。 Masson''s染色:CKD纤维化评分高于Sham组（P＜0.05）;与CKD组相比,JJHS-H组纤维化评分降低（P＜0.05）。 MSTN免疫组化染色:CKD组大鼠肾组织MSTN阳性细胞数较Sham组明显增多（ P＜ 0.001）;JJHS组MSTN阳性细胞数均较CKD组有所减少（P＜0.01 ）。 PGC-1α免疫组化染色:CKD组大鼠GA组织PGC-1α阳性细胞数较Sham组明显降低，JJHS-L组和JJHS-H组的PGC-1α阳性细胞均较CKD组有所增加。 TUNEL染色:相比于Sham组，CKD组GA组织细胞凋亡数明显增多，JJHS-L和JJHS-H两组GA组织细胞凋亡数较CKD组有所降低。 （5） JJHS对CKD大鼠骨骼肌萎缩相关表型的影响 与sham组相比，CKD大鼠中肌生成相关因子MyoG和MyoD表达均下降（P＜0.001），肌生成抑制相关因子MSTN和MuRF的表达均升高（P＜0.001）。JJHS治疗可上调CKD大鼠GA组织MyoG和MyoD表达水平（P＜0.05），降低该组织中MSTN和MuRF-1的表达水平（P＜0.001 ），尤以JJHS高剂量组最为明显。 2.细胞实验 （1）确定C2C12细胞的药物干预浓度 IS干预浓度:与Control组相比，IS 2.5 mM比IS 1.25 mM和IS 1mM更能显著抑制C2C12细胞肌纤维生长和分化，因此，后续细胞实验选用IS 2.5 mM作为C2C12细胞的干预浓度。 SAB干预浓度:与Control组相比，SAB 500nM、1 μM同时给药72 h可显著促进C2C12细胞肌纤维生长和分化（均P＜0.05）。因此SAB 500 nM、1 μM为C2C12细胞的干预浓度。 AMPK 抑制剂 Compound C 干预浓度:Compound C 10μM 较 Compound C 5μM和20μM更可显著抑制C2C12细胞肌纤维生长和分化（P＜0.05），且降低AMPK蛋白表达水平。因此，后续细胞实验选用Compound C 10μM作为C2C12细胞的干预浓度。 PGC-1α siRNA 干预浓度:PGC-1α siRNA 1 较 PGC-1α siRNA 2 和 PGC-1αsiRNA 3更能显著抑制C2C12细胞肌纤维生长和分化（均P＜0.01 ）,因此，后续细胞实验选用PGC-1α siRNA 1。 （2） SAB对IS环境下C2C12细胞分化的影响 与Control组相比，在光学显微镜下，lS2.5mM能明显抑制C2C12细胞分化，其肌纤维明显变窄、缩短、融合程度很低甚至完全不融合。SAB 500 nM和SAB1μM给药后均明显促进C2C12细胞分化，其肌纤维明显增粗、增长、融合程度更高。同时，两种浓度SAB均明显缓解IS对C2C12细胞分化的抑制作用。 与Control组相比，IS造模组肌生成相关因子MyoD和MyoG的基因和蛋白表达水平显著降低（均P＜0.05），相反MSTN和MuRF-1组的基因和蛋白表达水平显著增高（均P＜0.001 ）。SAB给药后组可上调MyoD和MyoG基因表达（均P＜0.001），同时下调MSTN和MuRF-1基因和蛋白表达水平（均P＜0.001 ）。 （3） SAB对IS环境下C2C12细胞AMPK/SIRT1/PGC1 α通路的激活作用 与Control组相比，IS造模组PGC-1α和SIRT1基因和蛋白表达水平显著降低（均P＜0.001 ）。SAB给药后可显著上调AMPK、PGC-1α和SIRT1基因和蛋白表达水平（均P＜0.001）。 （4） IS环境下，SAB通过AMPK/ SIRT1/PGC1α通路改善C2C12细胞的分化抑制 在 Compound C 作用下，与 IS+SAB 1 μM 组相比，IS+SAB 1 μM+CC 组PGC-1 α和SIRT1基因和蛋白表达水平显著降低（P＜0.01 ）。 在 PGC-1α si-RNA 作用下，与 NC Control 相比，NC IS MyoD 和 MyoG 的基因和蛋白表达水平显著降低（均P＜0.01），相反MSTN和MuRF-1组基因和蛋白表达水平显著增高（均P＜ 0.01）。与NC IS组相比，NC IS+SAB 1 μM给药可上调MyoD和MyoG表达平升高（均P＜0.001 ）。同时，下调 MSTN和MuRF-1 表达（P＜0.05）。与 NC Contro l 相比，PGC-1α si-RNA 各组均 MyoD 和MyoG的基因和的那白表达水平显著降低（P＜0.05）,相反MSTN和MuRF-1组基因和的蛋白表达水平显著增高。与NC IS+SAB 1 μM相比，PGC-1α si-RNA各组均MyoD和MyoG的表达水平均显著降低（P＜0.05 ）。相反，MSTN和MuRF-1组表达水平显著增高。 研究结论： 综上所述，JJHS能显著延缓CKD肌少症的进展。本研究体内动物实验证实，JJHS显著维持了 5/6肾切除诱导的CKD大鼠的体重、肌肉质量，改善了肾功能和肾脏病理，同时减轻了骨骼肌的萎缩，并减少了尿毒症毒素的蓄积。同时，该研究进一步证实，JJHS通过激活AMPK/PGC-1α信号通路，上调SIRT1及PGC-1α基因表达改善了 CKD肌少症大鼠的线粒体功能和结构，提高了运动耐力，有效地减少了骨骼肌细胞的凋亡。通过HPLC-QTRAP-MS/MS检测，鉴定了 JJHS的17种有效活性成分，其中SAB被确认为最主要的活性成分。基于此，体外细胞实验证实，SAB能够促进C2C12细胞分化，逆转了尿毒症环境下的肌细胞萎缩，并保护了线粒体的结构和功能。通过使用抑制剂和siRNA,双向证实，SAB以浓度依赖方式激活AMPK/SIRT1/PGC-1α通路，可有效在尿毒症毒素环境下保护C2C12细胞及其线粒体。本研究为治疗CKD相关肌肉问题提供了新的方向，同时也为JJHS的进一步研究和应用提供了有力支持。
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