摘要
目的： 肿瘤快速生长使其处于缺氧状态，缺氧诱导因子-1α（Hypoxicinduciblefactor-1α）是肿瘤适应缺氧微环境的主要因子。外泌体作为细胞间通讯的重要物质，参与了细胞与细胞之间的调控。树突状细胞（dendriticcell,DC）为体内最强的专职抗原提呈细胞，介导T细胞的抗肿瘤免疫应答。我们前期实验证实了DC通过摄取高表达HIF-1α的肿瘤源性外泌体，可以影响肿瘤放疗后DC介导的免疫应答。而外泌体HIF-1α是否也会影响DC的糖代谢并改变DC的抗肿瘤免疫应答目前还不清楚。本项目通过提取荷瘤小鼠血清外泌体，确定外泌体中HIF-1α表达量，并将HIF-1α表达量不同的外泌体刺激体外培养的DC，检测DC对外泌体的摄取、DC糖代谢的变化以及DC免疫功能的改变，并对其调控机制和信号通路进行初步分析。 实验方法： 1.PPI网络的构建：用String数据库（http://string.embl.de/）筛选HIF-1ɑ与糖酵解相关基因蛋白互作网络（Protein-ProteinInteraction,PPI）。从UCSC（https://xenabrowser.net/）数据库中抽取并下载TCGA黑色素瘤患者的血清外泌体表达谱，对样品中每个表达值进行了log（x+0.001）转换，得到标准化的数值。在Rstudio中进行编程，用spearman相关系数分析计算HIF-1ɑ在TCGA黑色素瘤血清外泌体中与糖酵解关键基因HK2和LDHA的相关性。 2.HIF-1α对肿瘤细胞糖代谢的影响：体外培养的小鼠黑色素瘤细胞株B16-F10，分为常氧组、低氧组、HIF-1α抑制剂组。收集各组细胞，Westernblot检测HIF-1α表达情况，RT-qPCR检测糖代谢相关基因：葡萄糖转运蛋白（GLUT1）,己糖激酶(HK2)，丙酮酸激酶（PKM2）,乳酸脱氢酶（LDHA）的mRNA表达水平。 3.HIF-1α对荷瘤小鼠肿瘤生长和糖代谢的影响：将小鼠随机分为：常氧组，低氧组，抑制剂组。通过皮下接种B16-F10细胞建立荷瘤小鼠模型，接种肿瘤后第7天，抑制剂组给与HIF-1α抑制剂PX-478（30mg/kg）灌胃处理，每3天分别灌胃一次，共6次；常氧组给与同样剂量的PBS处理。记录肿瘤生长情况，接种肿瘤第23天处死各组小鼠，取肿瘤组织称重，RT-qPCR检测检测脾脏组织PD-1、TIM-3、Galectin-9以及肿瘤组织糖代谢相关基因GLUT1、LDHA、PKM2和HK2的mRNA，紫外分光光度计比色法检测血清中乳酸浓度、丙酮酸水平、葡萄糖吸收量、ATP水平、乳酸脱氢酶活性；ELISA检测血清细胞因子IL-2、IFN-γ分泌水平。 4.小鼠血清外泌体的提取、鉴定以及HIF-1ɑ的表达情况检测：应用血清/血浆外泌体快速抽提试剂盒超速离心法分离上述各组血清外泌体，应用透射电子显微镜观察外泌体的形态结构，纳米粒径分析技术，Westernblot鉴定外泌体表征和标记蛋白TSG101、CD63、CD9等的表达情况以及各组外泌体HIF-1ɑ的表达情况。 5.血清外泌体HIF-1ɑ对DC糖代谢的影响：取小鼠骨髓细胞计数后，应用GM-CSF,IL-4诱导培养DC细胞。培养第6天加入用绿色荧光膜染料PKH67标记的各组荷瘤小鼠血清来源的外泌体共培养24h后，应用DAPI对DC细胞核染色，共聚焦显微镜下观察DC对外泌体的摄取和定位。提取各组DC总RNA，RT-qPCR检测GLUT1、LDHA、PKM2，HK2基因表达情况，检测各实验组DC细胞裂解物以及培养上清中乳酸浓度、丙酮酸水平、葡萄糖吸收量、ATP水平、乳酸脱氢酶活性。 6.血清外泌体HIF-1ɑ对DC成熟表型的影响：将各组血清外泌体刺激后的DC培养到第7天，流式细胞仪检测DC共刺激分子（MHCⅡ,CD40,CD80,CD86）表达的比例及共抑制分子（PD-L1、LAG-3）的表达情况；应用Transwell细胞迁移实验检测摄取各组血清外泌体后DC的迁移。 7.血清外泌体HIF-1ɑ影响DC对T细胞的分化和活化的影响：提取异种小鼠脾脏组织T细胞，与培养7天的各组DC进行混合淋巴细胞培养3天。流式细胞仪检测Treg；T细胞耗竭，T细胞活化的情况。ELISA法检测各组共培养上清中IL-2、IFN-γ的水平。 结果： 1.生物信息学分析显示，HIF-1α与Cd274、HK2、Ldha、PKM等糖酵解相关蛋白有蛋白互作关系。生物信息学预测肿瘤患者血清外泌体中HIF-1α与糖酵解相关基因HK2、LDHA的表达呈正相关（Plt;0.05）。 2.Westernblot检测HIF-1α表达情况，显示低氧组细胞HIF-1α表达水平明显高于常氧组；RT-qPCR检测结果表明糖酵解基因葡萄糖转运蛋白（GLUT1）,己糖激酶(HK2)，丙酮酸激酶（PKM2）,乳酸脱氢酶（LDHA）的表达也显著高于常氧组（Plt;0.05），抑制剂组HIF-1α表达水平明显降低、RT-qPCR检测结果显示糖酵解基因表达也下降（Plt;0.05）。 3.应用B16-F10构建了C57小鼠荷瘤模分别提取常氧组和低氧组的血清外泌体，并对提取的外泌体进行定量和表征型，Westernblot能够检测到外泌体特征性TSG101、CD63、CD9的表达，比较HIF-1α的蛋白表达水平，发现低氧组血清外泌体高表达HIF-1α，且能产生更多的血清外泌体（Plt;0.05）。对荷瘤小鼠进行PX478抑制剂灌胃处理，观察到，抑制剂组小鼠的肿瘤生长明显受到抑制，重量降低（Plt;0.05），肿瘤组织中HIF-1α的表达显著低于低氧组荷瘤小鼠（Plt;0.05），肿瘤组织的中糖酵解基因、脾脏淋巴细胞中免疫抑制分子PD-1、TIM3、GALACTIN9的表达均低于低氧组荷瘤小鼠（Plt;0.05），且血清中糖酵解产物明显减少，糖酵解水平减弱。 4.分别提取常氧组、低氧组、治疗组的血清外泌体进行特征鉴定，检测各组外泌体中HIF-1α的表达水平，与肿瘤组相比，治疗组血清外泌体中HIF-1α的表达水平明显降低（Plt;0.001）。用绿色荧光PKH67标记的各组血清外泌体与体外诱导培养的DC共培养，观察到各组血清外泌体均能被DC有效摄取。对摄取血清外泌体后的DC进行糖酵解基因、代谢产物的检测，发现摄取肿瘤组外泌体刺激的DC自身糖酵解水平升高显著高于常氧组（Plt;0.05）。 5.流式细胞术结果显示肿瘤组外泌体会引起DC成熟受损，抑制DC的免疫功能。而治疗组分泌血清外泌体能部分恢复DC成熟度（Plt;0.05）。对摄取各组血清外泌体后的DC进行迁移能力检测，发现肿瘤组DC迁移的细胞数量减少（Plt;0.01），抑制了DC的迁移能力。 6.混合淋巴细胞培养后，流式细胞术结果显示肿瘤组DC会导致T细胞活化减弱，Treg数量增多（Plt;0.05）；治疗组DC可增强T细胞活化减少Treg数量（Plt;0.05）。对T细胞耗竭进行检测，流式细胞术结果显示肿瘤组DC能够促进CD4/CD8阳性T细胞中PD-1、TIM-3、BTLA的表达，促进T细胞耗竭（Plt;0.05）；治疗组DC能改变并逆转T细胞耗竭状况（Plt;0.05）。采用ELISA确定混合淋巴细胞培养后的混合液中细胞因子分泌情况，肿瘤组上清INF-γ、IL-2释放水平明显降低（Plt;0.05），而治疗组上清中INF-γ、IL-2释放水平升高（Plt;0.05）。 结论： 1.低氧环境培养的B16-F10肿瘤细胞高表达HIF-1α并促进其自身糖酵解 2.HIF-1α抑制剂治疗后荷瘤小鼠可以抑制肿瘤生长，血清外泌体中HIF-1α表达水平下降，肿瘤组织糖酵解水平降低，抗肿瘤免疫功能得到恢复 3.HIF-1α能够以血清外泌体为载体，被DC摄取后促使糖酵解增加，抑制DC的成熟和迁移能力，并且抑制T细胞的抗肿瘤免疫应答
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