摘要
背景：甘青青兰（DracocephalitanguticiHerba）是唇形科青兰属甘青青兰DracocephalumtanguticumMaxim的干燥地上部分，其味甘、性寒、苦，具有清肝热、干黄水、愈疮、止血的功效。甘青青兰主要分布于中国甘肃、青海、四川、西藏，多见于海拔1900-4000米的干燥河谷的河岸、田野、草滩或松林边缘，而西藏被认为是甘青青兰的主要产区。藏药甘青青兰是较为常用的藏药材之一，涉及多种临床常用方剂，但现有的质量评价模式尚不能有效控制其质量，且其防治肝炎的药效物质基础尚不明确，而药效物质基础对于药材质量控制具有重要意义，值得进一步研究。 目的：基于超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱（UHPLC-Q/OrbitrapHRMS）对西藏地区的30批甘青青兰的化学成分进行分析，并利用多元统计学对其质量均一性进行了评价；建立了藏药甘青青兰的HPLC指纹图谱；采用血清药物化学及网络药理学的方法探索其防治肝炎的潜在活性成分，为藏药甘青青兰质量控制及药效物质基础提供参考。 方法：1.采用UHPLC-Q/OrbitrapHRMS技术，分析鉴定甘青青兰中的化学成分，并采用多元统计学方法寻找30批西藏产地茎枝、花叶含量不同的甘青青兰样本的之间的差异化合物。2.建立藏药甘青青兰的HPLC指纹图谱，对指纹图谱的整体相似度进行计算，通过主成分分析、偏最小二乘判别分析、熵权法结合灰色关联度综合评价30批甘青青兰质量。3.以中药血清药物化学为指导，采用UHPLC-Q/Orbitrap-HRMS技术分析甘青青兰在大鼠体内的入血原型成分、代谢产物及代谢途径。运用网络药理学及分子对接的方法对入血原型成分进行分析，探索甘青青兰防治肝炎的药效物质基础及作用机制。 结果：1.从甘青青兰中共鉴定77个化合物，包括黄酮类40个，苯丙素类11个，氨基酸类8个，其他类18个，其中11个化合物经与对照品比对确认。主成分分析（PCA）结果显示，30批样品被分为3组，Group1表现为茎枝含量较多，共有15批样本，Group2表现为花叶含量较多，共有12批样本，Group3表现为茎枝花叶含量适中，仅有3批样本。以VIPgt;1和Plt;0.05为指标，筛选出茎枝较多的Group1和花叶较多的Group2之间的差异化合物，并从中鉴定出32个化合物。其中有21个差异化合物均是Group2的平均含量大于Group1的平均含量。香叶木苷（VIP：13.144）和绿原酸（VIP：8.411）是两组之间是含量差异最大的化学成分，且Group2样本平均含量高于Group1的样本平均含量。 2.建立甘青青兰HPLC指纹图谱，共标定17个共有峰，结合高分辨质谱对这17个共有峰所含成分进行推测，共推测了其中15个峰。以甘青青兰对照指纹图谱作为参照，30批甘青青兰相似度在0.846～0.991之间，其中6批样品相似度在0.9以下。PCA分析和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）结果显示，30批样本在无监督情况下分为两组，Group1包含12批样本，Group2包含18批样本，表明样品质量有差异，并找到对样品分组影响较大的5个峰。通过灰色关联度结合熵权法对30批样本进行质量评价，同厂家的样本质量波动也较大，结合第一章结果分析，发现了4个差异化合物：绿原酸、木犀草苷、香叶木素-7-O-D-葡萄糖-D-木糖苷、木犀草素-7-O-芸香糖苷。 3.在大鼠血清样本中共找到了43个移行成分，包括22个原型成分以及21个代谢产物，原型成分包含咖啡酰奎宁酸类化合物3个，黄酮类化合物19个，以相对峰面积作为依据推测多数原型成分在60min时血药浓度达到最大。代谢产物来源于咖啡酰奎宁酸类化合物的9个，来源于黄酮类化合物的12个。咖啡酰奎宁酸类化合物在体内主要发生了Ⅰ相代谢水解反应和Ⅱ相代谢甲基化、硫酸化、葡萄糖醛酸等反应；黄酮类化合物在体内主要发生了Ⅰ相代谢水解、氧化反应和Ⅱ相代谢硫酸化、葡萄糖醛酸反应以及异构化。采用网络药理学手段对入血原型成分进行分析，构建了成分-靶点网络，找到了9个关键靶点，预测了14个甘青青兰防治肝炎的活性成分，包括3个咖啡酰奎宁酸类化合物，11个黄酮类化合物。结合第一章结果分析，找到了30批甘青青兰中9个较稳定且有效的成分，5个具有差异的有效成分：绿原酸、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-芸香糖苷、木犀草苷、香叶木苷。GO和KEGG分析结果表明甘青青兰活性成分主要参与了一氧化氮生物合成过程的正调控、细胞对雌二醇刺激的反应、细胞对β-淀粉样蛋白的反应等生物进程，涉及蛋白激酶C活性、蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性等功能，通过雌激素信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、甲状腺激素信号通路和松弛素信号通路发挥防治肝炎的作用。将14个核心成分与9个关键靶点分别进行分子对接后，所有成分与靶蛋白对接的结合能均小于-6，表明配体与受体分子能自发结合。 结论：本课题采用UPLC-Q/OrbitrapHRMS方法对甘青青兰中化学成分进行了较为全面的定性鉴别，共鉴定77个化合物，并结合多元统计分析，比较了茎枝、花叶含量不同的甘青青兰的差异化学成分，建立了甘青青兰的HPLC指纹图谱，对30批甘青青兰的质量进行评价，为甘青青兰质量控制研究提供参考；采用UHPLC-Q/OrbitrapHRMS方法对甘青青兰在大鼠血清中的原型成分及代谢产物进行分析，并以入血原型成分为基础，利用网络药理学及分子对接预测甘青青兰防治肝炎的活性成分及作用靶点，找到了14个甘青青兰防治肝炎的活性成分以及9个关键靶点，包括了3个咖啡酰奎宁酸类化合物，11个黄酮类化合物，为甘青青兰防治肝炎的药效物质基础的研究提供了参考。
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