摘要
世界卫生组织下属国际癌症研究机构发布的最新数据表明，估计2022年全球乳腺癌发病率在所有肿瘤中居于次席，约230万病例，而死亡率则排在所有肿瘤中的第四位，约67万病例。而在中国女性恶性肿瘤中，乳腺癌排在第二位，约为35.72万病例，死亡率约为7.5万病例。三阴性乳腺癌（Triplenegativebreastcancer，TNBC）是乳腺癌中的一个亚型，约占总乳腺癌人群的15-20%，该群体具有患病人群年轻化、转移率高和临床预后差等特点，由于缺乏明确的治疗靶点，所以目前的标准治疗方式仍然以化疗为主，但并未达到理想的效果。 肥胖TNBC患者通常伴随着高脂血症，脂质代谢异常是导致高复发转移的重要危险因素。一方面，高水平的脂肪酸氧化为肿瘤的无限增殖和远处转移提供了充足的能量，另一方面高水平的游离脂肪酸使得肿瘤细胞处于应激状态，进而发生了一系列的改变来适应异常的环境。其中，油酸是人体内脂肪组织和血浆游离脂肪酸中含量最高的单不饱和脂肪酸，在TNBC细胞的脂质代谢发挥重要的作用。因此，有必要探索油酸对于TNBC细胞的影响。 TNBC约有45%的患者会发生远处转移，是导致其死亡的重要原因。失巢凋亡是指细胞脱离细胞外基质后发生的程序性死亡。具有转移潜能的肿瘤细胞会通过各种机制来适应脱离基质后极端环境，从而避免失巢凋亡，可以向远处的器官转移。寻找失巢凋亡抵抗相关的机制及分子靶点对于TNBC的治疗及改善患者的预后具有重要的意义。但目前缺乏肥胖TNBC患者相关失巢凋亡的研究。 因此，本课题拟探索油酸在TNBC细胞失巢凋亡中的作用及潜在的机制。本课题共分为四个部分，第一部分通过TCGA乳腺癌数据构建预测乳腺癌进展和转移的预测模型，且模型基因提示乳腺癌转移和脂质代谢相关；第二部分探索了油酸对TNBC细胞的影响；第三部分探究了TNBC细胞失巢凋亡抵抗株与TNBC原始株生物学行为对比；第四部分探索油酸促进TNBC细胞失巢凋亡抵抗的作用机制。 第一部分乳腺癌转移相关的基因预测模型的构建与验证 目的：利用美国癌症基因图谱数据库（TheCancerGenomeAtlas，TCGA）和基因表达数据库（GeneExpressionOmnibus，GEO）筛选出乳腺中和转移相关的基因，构建预测乳腺癌进展和转移的预测模型并初步探索转移相关的线索。 方法： 1.利用R语言获取和转移相关的基因集，并通过无监督聚类将乳腺癌数据集分成两个亚组验证转移相关基因集的分类效果。 2.利用LASSO回归算法构建预测乳腺癌进展和转移的预测模型。 3.收取就诊于河北医科大学第四医院的原发和转移乳腺癌患者的组织样本和临床信息，利用qRT-PCR和westernblot验证模型基因的表达水平。 4.利用UniProt、GeneCards网站和生信分析明确模型基因与脂质代谢的相关性及功能。 结果： 1.利用WGCNA和单因素COX回归分析后获得与转移相关的基因集，具有良好的分类效能，其中G1有较差的预后；G1和G2在细胞干性、免疫微环境等方面有显著的差异。 2.经过LASSO回归算法构建预测模型，包括FEZ1、IGF2R和IL1RN等多个基因；该模型对乳腺癌的进展和转移具有良好的预测效果。 3.模型基因的mRNA水平和蛋白水平基本和生物信息学分析的结果一致；模型基因和脂质代谢密切相关。 结论： 1.FEZ1、IGF2R和IL1RN等多个基因构建的预测模型对乳腺癌的进展和转移的预测效能较好。 2.qRT-PCR和IHC证明FEZ1和IGF2R是乳腺癌转移的风险因子，而IL1RN是乳腺癌转移的保护因子。 3.模型基因可能通过脂质代谢参与到乳腺癌的远处转移过程。 第二部分油酸促进TNBC细胞的恶性生物学行为 目的：探索高脂肪酸环境即油酸对TNBC细胞的影响。 方法： 1.通过油红O染色实验检测油酸是否进入细胞。 2.通过CCK8细胞增殖实验检测油酸对TNBC细胞增殖能力的影响。 3.通过westernblot实验、qRT-PCR实验检测油酸对TNBC细胞上皮间质化变化和凋亡情况的影响。 4.通过划痕实验、Transwell实验检测油酸对TNBC细胞迁移和侵袭的影响。 5.通过转录组测序，富集分析探索油酸促进TNBC细胞恶性生物学行为的分子机制。 6.通过台盼蓝染色和流式细胞术检测油酸对TNBC细胞悬浮后死亡和凋亡的情况。 结果： 1.添加油酸后使TNBC细胞内的脂滴增加，增殖能力增强，差异具有统计学意义（P＜0.05）。 2.添加油酸后TNBC细胞上皮细胞标志物表达降低，间质细胞标志物表达增高。 3.油酸使TNBC细胞处于抗凋亡状态，差异具有统计学意义（P＜0.01）。 4.油酸使TNBC细胞迁移和侵袭能力增强，差异均有统计学意义（P＜0.05）。 5.油酸和失巢凋亡相关且能减少TNBC细胞悬浮后的死亡率和凋亡率（P＜0.05）。 结论： 1.油酸促进TNBC细胞的增殖能力。 2.油酸促进TNBC细胞上皮间质化的发生。 3.油酸促进TNBC细胞抗凋亡能力。 4.油酸促进TNBC细胞迁移和侵袭能力。 5.油酸促进TNBC细胞的抗失巢凋亡能力。 第三部分TNBC细胞失巢凋亡抵抗株的构建和生物学行为的探索 目的：探索TNBC细胞失巢凋亡抵抗株相较于TNBC细胞原始株是否有生物学行为改变 方法： 1.将TNBC细胞接种到超低附着六孔板中，使细胞悬浮一周，再接种到普通培养瓶中过夜，筛选出仍能贴壁存活的细胞称之为失巢凋亡抵抗株。 2.利用台盼蓝染色、流式细胞术和westernblot确定失巢凋亡抵抗株构建成功。 3.通过CCK8实验检测TNBC细胞失巢凋亡抵抗株的增殖能力。 4.通过细胞粘附实验检测TNBC细胞失巢凋亡抵抗株与纤连蛋白的粘附性。 5.通过划痕实验和Transwell实验检测失巢凋亡抵抗株的迁移和侵袭能力。 结果： 1.相较于TNBC细胞原始株，失巢凋亡抵抗株悬浮后细胞死亡数和凋亡数减少，差异均有统计学意义（P＜0.01），促凋亡蛋白Bax表达降低，抑凋亡蛋白Bcl-2表达增高，表明失巢凋亡抵抗株构建成功。 2.相较于TNBC细胞原始株，失巢凋亡抵抗株增殖能力增强，差异有统计学意义（P＜0.05）。 3.相较于TNBC细胞原始株，失巢凋亡抵抗株与纤连蛋白连接能力降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）。 4.相较于TNBC细胞原始株，失巢凋亡抵抗株的迁移和侵袭能力增强，差异具有统计学意义（P＜0.05）。 结论： 1.TNBC细胞失巢凋亡抵抗株构建成功。 2.相对于TNBC细胞原始株，失巢凋亡抵抗株与纤连蛋白粘附性降低；增殖、迁移和侵袭能力增强。 第四部分油酸通过ATF4促进TNBC细胞株抵抗失巢凋亡 目的：探索油酸促进TNBC细胞抵抗失巢凋亡的分子机制 方法： 1.通过油酸测序的差异表达基因和失巢凋亡相关基因的韦恩图获取交叉基因集。 2.通过qRT-PCR和westernblot实验验证交叉基因的表达水平是否和测序结果一致。 3.使用小干扰RNA（SmallinterferingRNA，siRNA）在TNBC细胞中干扰待选基因。采用qRT-PCR和westernblot实验检测待选基因的表达水平。 4.通过划痕实验和Transwell实验检测待选基因是否影响TNBC细胞的迁移和侵袭能力。 5.通过流式细胞术检测干扰待选基因后的TNBC细胞悬浮后的细胞凋亡数。 结果： 1.油酸测序差异基因和失巢凋亡相关基因的交叉基因共57个。 2.表达水平与测序结果一致的待选基因是ATF4和SIRT3。 3.相较于对照组，siRNA组的待选基因表达明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。 4.干扰待选基因不会直接影响TNBC细胞的迁移和侵袭，差异无统计学意义（P＞0.05）。 5.油酸通过ATF4促进TNBC细胞抵抗失巢凋亡，ATF4组和对照组差异有统计学意义（P＜0.01）。 结论： 1.油酸通过ATF4促进TNBC细胞抵抗失巢凋亡。 2.ATF4未直接促进TNBC细胞的迁移和侵袭能力。
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