摘要
水稻是人类重要的粮食作物。在未来以机械化直播为主的水稻生产中，播种后种子顺利整齐萌发，以及收获时无穗萌现象都是水稻高产的重要前提，而这均与水稻种子的萌发调控紧密相关。因此，研究水稻种子萌发调控的分子机制不仅有助于丰富对种子萌发过程的理解，而且为解决现代化农业生产中维持和提高种子活力等实际问题提供参考依据，对保证水稻正常生产及国家粮食安全有重大意义。 针对这一科学问题，实验室前期通过构建酵母单杂交文库，并以水稻α-淀粉酶1A（RAmy1A）的启动子序列为诱饵筛选出一个功能未知的MYB-CC类候选转录因子命名为OsMYBCC10。本课题将结合经典的分子遗传学方法，围绕验证OsMYBCC10调控RAmy1A表达、OsMYBCC10时空表达分析、转基因功能及作用机理分析开展工作。具体研究结果如下： 1）OsMYBCC10调控RAmy1A表达的验证：通过点对点酵母单杂交、凝胶阻滞实验、DNA-Pulldown结合qRT-PCR实验和双荧光素酶实验，确定OsMYBCC10与RAmy1A启动子片段含TAACAAA及TATCCA的序列元件结合，并促进RAmy1A表达。 2）OsMYBCC10基因的时空表达分析：通过RAP-DB数据库中OsMYBCC10在不同组织中相对表达、种子萌发的各个时期的不同组织（胚芽、胚乳等）、两周龄幼苗的根和叶片的GUS染色和转录水平检测OsMYBCC10基因的相对表达水平，确定OsMYBCC10基因在水稻种子萌发的胚及根中表达相对较强，在胚乳和叶片组织中表达较弱或基本不表达。 3）OsMYBCC10生物学功能分析：未添加GA时，mybcc10突变体萌发较为缓慢，超量表达株系（OE2、OE9）种子萌发较快。施加GA后，各材料的萌发速度均比对照快。mybcc10突变体种子萌发有所恢复，但仍迟于MYBCC10过表达和回补植株。大田种植条件下，突变体显著矮化，超量表达转基因植株（OE2、OE9）较高但差异不显著。在种子萌发48h时mybcc10突变体中RAmy表达量较低，突变体回复互补中RAmy1A表达量显著升高。施加GA的各株系48h胚中RAmy基因表达量均升高，突变体的RAmy1A的表达量较突变体回复互补少。随着萌发时间延长，各株系中RAmy基因家族成员表达水平分为先升高后降低和先降低后升高的两种类型。通过二硝基水杨酸氧化法检测各转基因材料萌发种子中α-淀粉酶活性，突变体中α-淀粉酶酶活力显著低于野生型（Kitaake，KT）。以上结果证明了OsMYBCC10突变降低了种子萌发过程中α-淀粉酶酶活性，淀粉不能及时充分降解，导致种子萌发迟缓。 4）OsMYBCC10作用机理分析：通过CoIP-MS技术分离鉴定OsMYBCC10的互作蛋白，共筛选到47个蛋白。通过亚细胞定位预测选定了MSL8（Myb/SANT-LIKE8，Os02t0104500），后续进行酵母双杂交实验。 综上所述，本研究发现一个新的转录因子OsMYBCC10，其在水稻种子萌发时会响应GA信号，并通过结合RAmy1A启动子的GARE和TAbox促进RAmy1A表达。与此同时，α-淀粉酶家族其他成员协同作用，共同调控水稻种子的萌发。本研究为研究MYB家族在调节水稻种子萌发过程中的作用奠定基础，以期解决农业生产中实际育种问题提供参考依据。
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