摘要
减数分裂是细胞进行DNA复制一次后，再连续分裂两次，生成单倍体精子或卵子的过程。有性生殖生物的精卵结合，使子代基因组又恢复成正常水平，保证生物物种染色体数目稳定。在减数分裂过程中，来自于父本和母本的同源染色体间会发生交叉。交叉的产生不仅赋予了子代遗传多样性，并且使得一对同源染色体紧密连接在一起，确保其在减Ⅰ后期各自精确地分离到子细胞中。目前已知，多种遗传疾病，如人的三体综合征与交叉缺陷导致的同源染色体分离异常密切相关。交叉的形成受到严格调控。在大多数物种里，每对同源染色体之间至少产生一个交叉，被称为强制性交叉。交叉的形成起始于生殖细胞自发产生的DNA双链断裂，通过同源重组修复并依赖一类在进化上高度保守的促交叉形成蛋白。秀丽隐杆线虫中促交叉形成蛋白包括细胞周期蛋白及激酶COSA-1-CDK-2、ZMM复合物(MSH-4/5和ZHP-3)以及解旋酶HIM-6等，其缺失会造成交叉无法形成，并导致染色体分离异常。在减数分裂的粗线期晚期不同的促交叉形成蛋白共定位于交叉指定位点，暗示促交叉形成蛋白复合物存在的可能性。但是，对于促交叉形成蛋白之间是否存在相互作用及这些蛋白在促进交叉形成过程中的作用机制，目前了解还十分有限。 本研究中我们结合邻位标记技术TurboID和酵母双杂交技术鉴定了已知促交叉形成蛋白间的相互作用。利用CRISPR-Cas9技术，我们构建了cosa-1::3×HA::TurboID的knock-in线虫。融合了生物素连接酶TurboID的COSA-1蛋白能正常定位在交叉指定位点，并能生物素化周边邻近的潜在互作蛋白。通过链霉亲和素亲和沉淀，我们发现生物素化的蛋白包括已知与COSA-1互作的CDK-2激酶以及其他的促交叉蛋白ZHP-3,HIM-6和MSH-5。通过酵母双杂交实验，我们证实了COSA-1与MSH-5以及ZHP-3之间存在直接互作，并且发现小鼠的mCNTDl(COSA-1同源蛋白)与mMSH5以及mRNF212(ZHP-3同源蛋白)之间也存在互作。上述结果表明，促交叉形成蛋白间很可能通过保守性的相互作用形成促交叉复合物。 为了进一步确定COSA-1与MSH-5以及ZHP-3之间互作的区域，我们根据之前的研究推测COSA-1的互作区域可能位于N端的无序结构域,通过对N端序列进行一系列的截短突变，发现第40-53位氨基酸对于COSA-1与MSH-5以及ZHP-3之间互作至关重要。根据COSA-1在不同物种的同源蛋白序列比对和酵母双杂交实验结果，我们进一步确定了N端互作区域中的关键氨基酸残基。 为了在体内分析上述生化的互作结果，我们首先构建了互作区域内4个和6个保守氨基酸的线虫突变体cosa-1-4A和cosa-1-6A。cosa-1-4A和cosa-1-6A突变体中交叉指定正常，但COSA-1和CDK-2在交叉指定位点的定位明显减弱，同时引发交叉形成缺陷并且伴随着后代胚胎存活率显著降低和后代雄虫比例显著升高。为了进一步探究交叉形成失败的原因，我们利用染色体铺展和超高分辨率显微成像技术，发现cosa-1-4A突变会影响MSH-5和HIM-6以及联会复合体在交叉指定位点处的空间构象。为了进一步验证COSA-1-4A与其他促交叉形成蛋白的互作缺陷是导致交叉无法形成的直接原因，我们利用GFP-nanobody将COSA-1-4A锚定到交叉指定位点，发现COSA-1-4A以及CDK-2的定位被很大程度挽救，而且交叉缺陷导致的表型(终变期细胞核二价体的形成和后代雄虫比例)也得到了部分挽回。上述结果表明，COSA-1与其他促交叉形成蛋白的相互作用对交叉形成至关重要，并且交叉指定和交叉成熟是两个既相互依赖又相对独立的过程。 为了深入探究促交叉形成蛋白复合物在交叉形成中的作用机制，我们利用生长素诱导的蛋白降解系统((a)uxin-(i)nducible(d)egron，AID)在性腺中特异地降解交叉形成拮抗蛋白RTEL-1,发现RTEL-1降解可以有效地挽救cosa-1-4A突变体的减数分裂缺陷表型。此外，当介导同源重组中间产物Hollidayjunction解离的支架蛋白SLX-4突变后，COSA-1、ZHP-3和MSH-5在终变期细胞染色体上解离延迟。cosa-1-4A;slx-4双突变体中单价体数量、胚胎致死率和后代雄虫比例显著升高。上述结果表明，促交叉形成蛋白复合物可以有效保护尚未成熟的同源重组中间产物，防止同源染色体提前解离。 综上所述，本论文解析了COSA-1和其他促交叉形成蛋白间的相互作用以及与互作相关的生物学功能，并进一步揭示了促交叉复合物可以保护并稳定同源重组修复中间产物，从而确保交叉的形成。上述研究为了解减数分裂异常导致的配子发生障碍而引发的不孕不育提供了新的线索。
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