摘要
研究背景:自身免疫性肝炎(Autoimmunehepatitis，AIH)是一种由免疫系统失衡引发的肝脏慢性炎症性疾病，是全球重要的公共卫生问题。研究显示，自身免疫性肝炎在我国的流行率和发病率均呈逐年上升趋势。由于自身免疫性肝炎的病因与发病机制尚未得到充分阐明，针对自身免疫性肝炎的治疗方案仍非常有限。目前，临床上常使用糖皮质激素、硫唑嘌呤、免疫抑制剂等药物治疗自身免疫性肝炎，但长期使用后会伴随许多的不良反应。因此，迫切需要对自身免疫性肝炎的发病机制进行深入探究和全面阐明，并寻求更为安全、有效的治疗策略。 刀豆蛋白A(ConcanavalinA,ConA)能够诱导免疫细胞活化与增殖，进而造成免疫性肝损伤。ConA诱导的免疫相关肝损伤动物模型被广泛应用于AIH的研究。巨噬细胞在自身免疫性肝炎的发病过程中发挥重要的免疫调节作用，巨噬细胞可以通过产生巨噬细胞炎症蛋白-2、角质形成细胞趋化因子、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等细胞因子导致肝脏损伤。由巨噬细胞侵袭引起的肝脏炎症是ConA诱导的免疫相关肝损伤的主要特征。因此，针对巨噬细胞进行治疗可能成为有效应对自身免疫性肝炎的方法。 山茱萸(CornusofficinalisSieb.etZucc.)是我国传统中药，最初被《神农本草经》所记载，具有益肝补肾、涩精固脱的功效。山茱萸新苷(Cornuside，Corn)是山茱萸中的环烯醚萜苷类成分之一，具备抗炎、抗氧化和肝脏保护作用。相关研究发现，山茱萸新苷能够以剂量相关的方式有效地减少巨噬细胞产生NO与PGE2,并在多种炎症性疾病中展示出良好的抗炎、抗氧化和抗凋亡等功能。然而，山茱萸新苷在免疫相关肝损伤中的作用还没有充分深入的探究与报道。且鉴于巨噬细胞在免疫相关肝损伤中重要作用，深入探究山茱萸新苷通过调控巨噬细胞缓解免疫相关肝损伤，可能会成为防治自身免疫性肝炎的新策略。 研究目的:本研究旨在利用ConA诱导的免疫相关肝损伤动物模型，探究山茱萸新苷调控巨噬细胞对免疫相关肝损伤的保护作用和作用机制，为治疗自身免疫性肝炎提供理论基础和实验依据。 研究方法: 1.运用网络药理学分析确定山茱萸新苷在自身免疫性肝炎中的潜在靶基因与信号通路:利用PharmMapper数据库对山茱萸新苷进行靶点筛选，并结合OMIM数据库、DrugBank数据库、GeneCards数据库和DisGeNET数据库来寻找治疗自身免疫性肝炎的靶点。将药物和疾病的靶点进行交集运算，然后在Metascape数据库中进行KEGG分析和GO富集分析。 2.探究山茱萸新苷在ConA诱导的免疫相关肝损伤中的作用:使用6周龄的雄性C57BL/6小鼠构建ConA诱导的免疫相关肝损伤模型，用不同浓度的山茱萸新苷处理。 (1)观察小鼠肝脏充血情况; (2)检测小鼠血清ALT、AST水平; (3)H&E染色观察肝组织病理变化。 3.探究山茱萸新苷对ConA诱导的免疫相关肝损伤中肝脏氧化应激与细胞凋亡的影响:取6周龄雄性C57BL/6小鼠，构建ConA诱导的免疫相关肝损伤模型，用不同浓度的山茱萸新苷处理。 (1)检测肝脏氧化应激相关指标，包括MPO、SOD与MDA; (2)TUNEL法检测肝脏细胞凋亡情况。 4.探究山茱萸新苷对ConA诱导的免疫相关肝损伤中炎症反应的影响:使用6周龄雄性C57BL/6小鼠，构建ConA诱导的免疫相关肝损伤模型，用不同浓度的山茱萸新苷进行处理。 (1)流式细胞术检测小鼠脾脏和肝脏中各种免疫细胞的比例及活化情况; (2)ELISA检测小鼠血清中炎症相关细胞因子表达水平; (3)qRT-PCR检测小鼠肝脏中与炎症相关的细胞因子mRNA水平的表达情况。 5.根据研究方法4的结果，山茱萸新苷影响小鼠肝脏内巨噬细胞的聚集与活化。接下来我们将进一步探究巨噬细胞在山茱萸新苷保护ConA诱导的免疫相关肝损伤中的作用:体外诱导小鼠骨髓来源的巨噬细胞，加入不同浓度的山茱萸新苷处理。检测山茱萸新苷对巨噬细胞极化的影响。 (1)检测山茱萸新苷对巨噬细胞活性的影响; (2)流式细胞术检测山茱萸新苷对M1型巨噬细胞极化的影响; (3)ELISA检测体外培养细胞上清中M1型巨噬细胞标志性细胞因子表达水平; (4)qRT-PCR检测M1型巨噬细胞标志性细胞因子mRNA水平的表达情况。 6.探究山茱萸新苷调控M1型巨噬细胞极化的分子机制:体外诱导小鼠骨髓来源的巨噬细胞，使用不同浓度的山茱萸新苷进行处理。提取蛋白，通过Westernblot技术检测相关信号通路关键蛋白的表达水平。 结果: 1.网络药理学分析结果表明，山茱萸新苷可能通过调节氧化应激、细胞凋亡和炎症反应参与AIH的治疗。 2.山茱萸新苷能够缓解ConA诱导的免疫相关肝损伤。 (1)山茱萸新苷有效缓解了小鼠肝脏充血肿胀;(2)山茱萸新苷可显著降低模型小鼠血清中ALT、AST水平;(3)H&E染色发现山茱萸新苷能够减轻ConA诱导的肝组织损伤。 3.山茱萸新苷抑制ConA诱导的免疫相关肝损伤中的氧化应激反应与肝细胞凋亡。(1)山茱萸新苷具有降低MDA、MPO水平和提高SOD水平的作用，有效抑制氧化应激反应;(2)TUNEL法检测发现，山茱萸新苷处理后肝细胞凋亡情况得到明显缓解。 4.山茱萸新苷抑制ConA诱导的免疫相关肝损伤中的炎症反应。(1)流式结果显示，山茱萸新苷能够有效抑制肝脏中NKT细胞的浸润与活化、CD8+T细胞的浸润与CD4+T细胞的活化，降低巨噬细胞的比例;(2)山茱萸新苷还可以通过促进MDSCs的聚集发挥抑制炎症、保护肝脏的作用;(3)ELISA与qRT-PCR结果显示山茱萸新苷显著降低了血清与肝组织中IL-6、IL-12/p40、TNF-α、IL-iβ的表达水平。 5.山茱萸新苷能够有效抑制M1型巨噬细胞极化。(1)山茱萸新苷不影响M1型巨噬细胞的活性;(2)流式细胞术结果表明，山茱萸新苷能够减少M1型巨噬细胞的比例，抑制M1型巨噬细胞活化;(3)ELISA结果显示，山茱萸新苷可以降低培养上清中M1型巨噬细胞标志物IL-6、IL-12/p40、TNF-α的表达水平。(4)qRT-PCR结果显示，山茱萸新苷能够抑制M1型巨噬细胞标志分子IL-6、IL-12/p40、iNOS的mRNA水平的表达; 6.山茱萸新苷可通过抑制MAPK通路缓解ConA诱导的免疫相关肝损伤。Westernblot结果显示山茱萸新苷处理的巨噬细胞中JNK和ERK的磷酸化均受到了显著抑制。 结论: 1.山茱萸新苷可通过调节氧化应激、抗细胞凋亡和炎症反应以及调控免疫细胞缓解ConA诱导的免疫相关肝损伤: 2.山茱萸新苷可通过抑制MAPK信号通路中的ERK和JNK的磷酸化来影响巨噬细胞极化，从而抑制炎症反应。
NETL