摘要
作为重要的次级代谢产物，黄酮类化合物在植物生长和防御抗逆等方面发挥着重要作用，具有包括抗氧化和清除自由基、抗炎、抗菌和抗病毒、抗肿瘤等多种药理活性。类黄酮种类繁多，甲基化、羟基化、异戊烯基化和糖基化等修饰反应使得其结构更加复杂。其中，糖基化修饰是最广泛的一种。在植物中，类黄酮糖苷是黄酮类化合物的主要存在形式。由于糖的类型、取代的位置和数量的不同，类黄酮糖苷的结构是多样的。其中，类黄酮葡萄糖醛酸苷是一类特殊的活性代谢产物。葡萄糖醛酸化反应一般会引起苷元分子亲水性的增加和活性的变化，一些类黄酮葡萄糖醛酸苷以其独特的药理活性已经被应用于临床上心血管疾病、泌尿系统疾病的治疗，如灯盏花甲素、灯盏花乙素、刺槐苷等。植物中的糖基化反应由UDP-糖基转移酶（Uridinediphosphateglycosyltransferases,UGTs）催化，其在植物的次生代谢中扮演重要角色。通过深入研究UGTs的活性、对底物的特异性以及调控机制，可以更全面地理解植物次生代谢途径的调控网络和更好地应用于生物合成。 唇形科植物香青兰（DracocephalummoldavicaL.）中已被报道含有多种类黄酮葡萄糖醛酸苷，包括灯盏花甲素、金合欢素-7-O-葡萄糖醛酸苷、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷、香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷等。为了解析香青兰中类黄酮葡萄糖醛酸苷类化合物生物合成途径中的关键糖基转移酶基因，本研究对香青兰中的糖基转移酶基因进行了系统挖掘和功能鉴定，进一步的合成生物学应用实现了类黄酮葡萄糖醛酸苷和类黄酮C-葡萄糖苷在大肠杆菌中的生物合成。此外，实验室前期从苔类植物地钱（Marchantiapolymorpha）中克隆得到了两个类黄酮葡萄糖醛酸转移酶基因MpUGT742A1和MpUGT736B1,具有高催化效率和广泛的底物选择性，能同时催化产生类黄酮单葡萄糖醛酸苷和二葡萄糖醛酸苷。本研究基于这两个葡萄糖醛酸转移酶基因构建了工程菌株，实现了更多种类的类黄酮葡萄糖醛酸苷的生物合成。 1.香青兰中UDP-糖基转移酶的基因克隆、功能鉴定与合成生物学应用。 香青兰中与类黄酮葡萄糖醛酸苷合成相关的UDP-糖基转移酶基因尚未被鉴定。本研究从香青兰转录组数据库中筛选得到6个UGTs候选基因，系统发育分析显示DmUGT1和DmUGT2可能是类黄酮7-O-葡萄糖醛酸转移酶。体外酶活分析结果表明，DmUGT1和DmUGT2是双功能的类黄酮7-O-葡萄糖醛酸/葡萄糖基转移酶，对包括黄酮、黄酮醇、黄烷酮、二氢黄酮醇、二氢查尔酮和异黄酮在内的各种化合物具有高转化率;DmUGT3和DmUGT4是UDP-葡萄糖基转移酶，尤其是DmUGT4对部分底物表现出多位点的糖基化活性;DmCGT1是I型的类黄酮C-糖基转移酶，能催化2-羟基柚皮素和根皮素的二C-糖基化。通过成分分析和表达模式分析验证了DmUGT1和DmUGT2与香青兰中类黄酮葡萄糖醛酸苷积累的相关性。通过同源模拟和定点突变分析阐述了DmUGT1的糖供体选择性机制，结果证明S127是影响DmUGT1对UDP-葡萄糖醛酸选择性的关键氨基酸，Y373是影响DmUGT1对UDP-葡萄糖活性的关键氨基酸。应用DmUGT1和DmCGT1分别构建了工程菌株，分别实现了多种类黄酮葡萄糖醛酸苷、根皮素碳苷在大肠杆菌中的生物合成;对DmUGT1的密码子优化进一步提升了菌株转化效率。 2.地钱黄酮葡萄糖醛酸转移酶的合成生物学应用。 实验室前期工作中获得的两个糖基转移酶MpUGT742A1和MpUGT736B1能催化类黄酮不同位点的葡萄糖醛酸化，生成相应的单糖苷和二糖苷。本研究使用MpUGT736B1,体外酶催化合成了芹菜素的单糖苷和二糖苷，结构鉴定为芹菜素-4''-O-葡萄糖醛酸苷和芹菜素-7,4''-二-O-葡萄糖醛酸苷，进一步明晰了MpUGT736B1的糖基化区域选择性特点。基于MpUGT742A1和MpUGT736B1分别构建了工程菌株，实现了多种不同位点取代的类黄酮单/二葡萄糖醛酸苷的体内生物合成。 本研究在香青兰中首次发现UDP-葡萄糖醛酸转移酶和C-糖基转移酶基因，为生物合成多种结构类型的糖苷类化合物提供了新的候选基因。工程菌株的构建提供了一种绿色、高效和低成本的方式，实现了体内各种类黄酮糖苷的高效合成，为新型活性糖苷产物的开发和应用开辟了新的途径。
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