摘要
马尾松（Pinusmassoniana）作为具有较强抗旱能力的先锋树种，广泛分布于我国南方地区。大部分产区受副热带高压的影响，夏季常出现持续高温干旱天气。高温干旱复合胁迫下，植物试图通过增加蒸腾散热以冷却叶片，但干旱促使植物关闭气孔以减少水分损失，这使得植物必须在防止水分流失和防止过热之间进行平衡。研究表明，水通道蛋白（AQP）通过调控水和其它小分子物质的跨膜运输，在维持植株水分平衡中发挥着重要作用。为了系统性地探究马尾松PmAQPs基因对干旱、高温及高温干旱复合胁迫的应答，挖掘马尾松抗逆基因。本研究基于马尾松苗期转录组数据，筛选和鉴定马尾松AQPs基因家族成员。通过高温干旱复合胁迫试验，进一步筛选出与高温干旱相关的PmAQPs基因。利用生物信息学和亚细胞定位的方法，深入研究马尾松AQPs基因家族成员的理化性质和表达定位情况。为了进一步探究马尾松水通道蛋白基因PmNIP2;1响应高温干旱胁迫的机制，构建了过表达PmNIP2;1烟草植株并对其进行高温干旱胁迫处理。主要研究结果如下： 1.高温干旱胁迫下马尾松幼苗生理指标的变化规律 马尾松幼苗通过增加抗氧化酶活性，改变渗透调节物质含量以适应干旱、高温及高温干旱复合胁迫，但胁迫仍造成马尾松苗细胞损伤。与对照相比，SOD（超氧化物歧化酶）和CAT（过氧化氢酶）活性增强了18.18%~62.48%和16.26%~859.21%；SP（可溶性蛋白）含量增加了16.78%~139.32%；MDA（丙二醛）含量增加了26.79%~110.89%。植株应对干旱、高温和高温干旱复合胁迫采取的生理反应不同。干旱胁迫下，随着干旱程度的加深，马尾松苗MDA、Pro（脯氨酸）、SP含量和SOD、CAT活性较对照的增幅增加。高温胁迫下的马尾松苗抗氧化能力强于干旱胁迫，且随着高温胁迫时间的延长，针叶SOD、CAT活性较对照的增幅持续增加。高温干旱复合胁迫下马尾松幼苗的生理反应，不能仅仅由苗木在单一的高温或干旱胁迫下的反应简单推测得知。 2.马尾松AQPs基因家族成员的生物信息学分析 分析马尾松幼苗转录组数据，筛选鉴定出30个马尾松AQPs基因家族成员。系统发育分析将30个PmAQPs分为4个亚家族：12个PIPs、11个TIPs、5个NIPs、2个SIPs。PmAQPs的氨基酸数目在185~325之间，相对分子质量在19.331~34.625kD之间。PmAQPs均为稳定疏水蛋白。9个PmAQPs的等电点小于6.5而显酸性，17个PmAQPs等电点大于7.5而呈碱性。亚细胞定位预测结果显示，所有PmAQPs均定位在质膜。大部分PmAQPs具有多位置定位，同时定位于质膜、液泡、细胞质、高尔基体。在motif分析中，除SIP亚家族外，PIP、TIP、NIP亚家族都具有Motif1。除PmSIP2;1，其余所有PmAQPs均含有Motif2。其中Motif7、Motif8、Motif9是PIP特异性的，Motif6、Motif10是TIP特异性的。 3.马尾松AQPs基因家族成员的在胁迫下的表达模式分析 实时荧光定量结果显示，13个PmAQPs的表达明显受到干旱、高温及高温干旱复合胁迫的影响。在干旱、高温及高温干旱复合胁迫下，PmPIP1;7、PmPIP2;1、PmPIP2;3、PmTIP1;2、PmTIP2;3表达显著上调；PmPIP2;5和PmSIP1;1表达显著下调。PmNIP2;1、PmNIP3;1、PmTIP1;3的表达变化更加复杂。PmAQPs表达受胁迫类型和胁迫程度影响。同一PmAQPs基因在不同胁迫类型，不同胁迫程度下，表达模式不同。不同胁迫类型下植株选择以不同的方式调控不同的PmAQPs基因。复合胁迫下PmAQPs表达调控较单一胁迫复杂。单一胁迫和复合胁迫下的表达量变化模式呈现出多种关系，不能以两种单一胁迫下的表达量变化推测复合胁迫下基因的变化规律。高温胁迫下马尾松针叶中水分等其他物质的运输加快，更多的PmAQPs的表达量上调。克隆PmPIP1;6、PmPIP2;1、PmPIP2;2的最长ORF，并构建GFP荧光融合表达载体。通过农杆菌注射法瞬时侵染烟草下表皮，荧光观察。结果发现，PmPIP2;1蛋白定位于液泡上；PmPIP1;6和PmPIP2;2蛋白定位于内质网、质膜等多个位置。 4.过表达PmNIP2;1的烟草对高温干旱胁迫的逆境响应 通过同时胁迫处理（干旱、高温及高温干旱复合胁迫）转PmNIP2;1烟草和野生型烟草，对比分析植株表型、抗逆生理指标和抗逆基因的表达差异。转PmNIP2;1烟草表现出对干旱、高温及高温干旱复合胁迫的耐受增强。PmNIP2;1的过表达促进了转基因烟草根系发育。正常生长条件下，野生型和转PmNIP2;1烟草植株地上部分生长状况相似。胁迫条件下，野生型烟草叶片萎焉，生长受阻。而转PmNIP2;1烟草仍保持正常的生长状态，并且叶片MDA含量显著低于野生型。RT-qPCR结果也显示，烟草参与高温和干旱胁迫响应的相关基因（NTAQP、NtHSF和WRKY），在不同胁迫处理下的差异表达。PmNIP2;1的过表达促进了转基因烟草根系发育，提高了烟草对干旱、高温及高温干旱复合胁迫的耐受性。 综上所述，本研究对马尾松苗期AQPs基因家族进行了系统的生信分析，经过胁迫试验及RT-qPCR检测，筛选出多个参与马尾松高温干旱胁迫应答的PmAQPs基因。经过遗传转化烟草验证基因功能，鉴定出增强烟草对干旱、高温及高温干旱复合胁迫耐受性的马尾松水通道蛋白PmNIP2;1基因。PmNIP2;1有可能在增强马尾松抗旱方面同样发挥着重要作用，为进一步探究马尾松的抗逆性机制奠定基础。
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