摘要
目的：牙周炎是由牙菌斑生物膜诱导的可以使牙支持组织发生破坏的一种慢性炎症性疾病，目前已成为成人牙齿丧失的主要原因。在慢性牙周炎情况下，机体产生的各种细胞因子及效应分子可通过多种途径对牙周组织造成损伤。消退素D1（ResolvinD1，RvD1）是一类由ω-3多不饱和脂肪酸经环氧酶-2（COX-2）或脂氧酶（LO）催化产生的具有炎症抑制作用的内源性脂质介质，目前研究发现其对促进炎症消退及修复组织再生起着积极作用。 本研究主要通过探索RvD1在细菌脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）诱导的人牙周膜细胞（humanPeriodontalligamentcells，hPDLCs）氧化应激及凋亡中的影响及其发挥保护作用的相关机制，为消退素治疗提供更多作用靶点。 方法： （1）hPDLCs提取培养及LPS浓度的确定。在患者知情同意下获取年轻健康恒牙，组织块法提取hPDLCs并用免疫荧光染色（IF）进行鉴定，采用细胞凋亡检测及Caspase3活性检测确定LPS最适宜作用浓度。 （2）RvD1对LPS诱导的hPDLCs氧化应激的影响。利用活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）检测试剂盒测定细胞中ROS、MDA水平，采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）法检测氧化应激相关基因的表达。 （3）RvD1对LPS诱导的hPDLCs凋亡的影响。利用流式细胞术对凋亡细胞进行定量分析，使用Caspase3活性检测试剂盒测定Caspase3活性，采用RT-qPCR技术、蛋白质免疫印迹法（Western-blot，WB)技术检测凋亡基因及蛋白的表达，采用IF及WB检测RvD1的特定表面受体脂氧素A4受体/甲酰肽受体2（ALX/FPR2）的表达。 结果： （1）镜下观察发现大量长梭形细胞自组织块周围爬出，且免疫荧光染色结果显示细胞丝蛋白染色阳性、角蛋白染色阴性；流式检测及Caspase3活性检测结果显示：LPS刺激会使细胞凋亡比率明显增加，Caspase3活性显著增强，并且均显示明显的浓度依赖性。 （2）1μg/mLLPS刺激24h能够使hPDLCs中ROS及MDA生成增多，而RvD1作用可以降低LPS诱导的hPDLCs中ROS及MDA水平；同时LPS刺激可以使抗氧化基因的表达下调，而RvD1作用可以上调抗氧化基因的表达。 （3）1μg/mLLPS刺激24h能够使Caspase3活性及细胞凋亡比率上调，而RvD1可以降低LPS诱导的hPDLCs凋亡比率增加及Caspase3活性增强；RT-qPCR结果显示，与对照组相比，LPS组促炎基因TNF-α和促凋亡相关基因Bax、Caspase9、Caspase3等的表达上调，抗凋亡基因Bcl-2及AKT的表达下调，然而与LPS组相比，LPS+RvD1组促炎及促凋亡相关基因表达下调，抗凋亡基因及AKT表达上调；WB结果也表明LPS可以上调促凋亡相关蛋白表达，抑制抗凋亡蛋白的表达，而RvD1作用可以逆转这种改变。WB及IF结果均显示ALX/FPR2受体可以在牙周膜细胞中表达，且与对照组相比，各实验组ALX/FPR2的表达均有增加趋势，但在LPS+RvD1组ALX/FPR2表达最高。 结论：1μg/mLLPS刺激24h能够使hPDLCs产生氧化应激反应并诱导hPDLCs凋亡，RvD1可以通过抑制氧化应激反应及细胞凋亡的发生保护hPDLCs免受损伤。
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