摘要
目的： 脂质代谢异常作为肿瘤代谢重编程的重要组成部分，是胃肠道肿瘤增殖、侵袭、迁移的病理基础，靶向脂质代谢在癌症中的关键基因成为了近年来癌症治疗的新方向。本研究通过胃癌中脂质代谢基因的综合分析，对胃癌进行脂质代谢相关分子亚型的鉴定和预后模型的构建，旨在探究胃癌中以脂质代谢为基础的预后生物标志物和治疗靶点。 研究方法： 1.通过生物信息学的方法，对可能调节胃癌中脂质代谢的基因进行筛选和鉴定，并进行多组学的综合分析。在TCGA-STAD队列中基于脂质代谢基因的表达水平，通过一致性聚类的方法，对胃癌脂质代谢基因相关分子亚型进行鉴定和分析。基于胃癌中脂质代谢基因的表达和预后，通过Lasso回归构建预后风险评分，将胃癌患者进行风险分层。通过Cox回归分析构建Nomogram预后模型，评估其对胃癌患者的生存率的预测效能。 2.联合Lasso回归、蛋白互作和Cox回归分析，筛选出胃癌脂质代谢基因中关键的枢纽基因ABCA1，并在TCGA-STAD队列中对ABCA1进行多组学的综合分析。 3.在细胞和组织水平上，探究ABCA1在胃癌中的表达差异。通过胃癌组织及相关临床资料，分析ABCA1表达和临床病理特征的相关性。 4.通过慢病毒感染构建ABCA1稳定敲低的细胞株，并从体外实验和体内实验探究ABCA1敲低后对胃癌细胞恶性表型的影响。 5.通过真核转录组测序和westernblotting实验，探究ABCA1敲低后对胃癌细胞恶性表型影响的分子机制，同时通过回复实验对可能的分子机制进行进一步验证。 6.通过虚拟筛选、分子对接和分子动力学模拟技术，筛选出以ABCA1蛋白为作用靶点的抑制剂，并进行体外实验的初步验证。 研究结果： 1.在胃癌中一共筛选出12个重要的脂质代谢基因，它们之间存在着密切的相互作用关系。在TCGA-SATD队列中，这些基因高表达的胃癌患者有着更高的临床病理分期和更差预后，并且它们的表达水平与多种肿瘤相关信号通路相关，比如PI3K-AKT、TSC-mTOR、HormoneER、EMT、Apoptosis和HormoneAR通路。基因突变分析表明，12个脂质代谢基因在TCGA-SATD队列中基因突变总频率为27%，并且基因突变组胃癌患者的TMB和MSI评分要显著高于未突变组，而具有高水平TMB和MSI评分的胃癌患者有着更好的预后。免疫浸润分析显示12个脂质代谢基因的综合表达水平和免疫浸润水平呈正相关。一致性聚类分析一共鉴定出了2种脂质代谢相关的胃癌分子亚型(C1亚型和C2亚型)，C2亚型中脂质代谢基因表达水平更高。此外，C2亚型有着更高的临床病理分期和预后。C1和C2亚型间差异基因功能富集分析表明这些差异基因主要富集在细胞的黏附和PI3K-AKT信号通路等方面。突变分析显示，C2亚型有着更低水平的TMB和MSI评分。免疫浸润和免疫治疗分析显示，C2亚型有着更高的免疫浸润水平、免疫检查点相关基因表达水平、Tide评分以及更低水平的IPS评分。化疗药物敏感性分析表明，C2亚型对多种化疗药物的敏感性更差。在TCGA-SATD队列中，通过Lasso回归分析筛选出了4个关键的脂质代谢预后分子(IL6、ABCA1、APOA1和CD36)。基于这4个基因表达和预后构建了Lasso风险评分，结果表明该风险评分能够较好区分TCGA-STAD和GSE66229队列中高、低风险组的不同胃癌患者。基于Cox回归分析，我们构建了Nomogram预后模型并通过多种方法对该模型进行了评估，结果显示该模型对胃癌患者生存率具有较高的预测效能。 化疗药物敏感性分析表明，ABCA1低表达组对大多数化疗药物的敏感性更高。3.ABCA1在胃癌细胞和组织中的表达水平显著上调，包括mRNA和蛋白水2.通过联合Lasso回归、蛋白互作和Cox回归分析，鉴定出了胃癌脂质代谢基因中关键的枢纽基因ABCA1，它是影响胃癌患者总生存预后的独立危险因素之一，并和多种临床病理分期密切相关。基因功能富集分析表明ABCA1可能参与了胃癌的免疫调节、细胞黏附和PI3K-AKT信号通路等。突变分析表明，ABCA1突变频率最高的位点为A1407T位点，突变分类主要为为错义突变。ABCA1高、低表达组间突变频率排名前4的基因分别是TTN、TP53、MUC16和LRP1B。免疫浸润分析显示，ABCA1高表达组有着更高的免疫浸润水平和免疫检查点相关基因表达水平。免疫治疗分析表明，ABCA1高表达组有着更低水平的TMB评分，MSI评分，NALs评分，IPS评分以及更高水平的Tide评分。平。ABCA1的表达水平和多种临床病理特征密切相关，包括组织学分级、N分期、Lauren分型、临床分期以及阳性淋巴结占比。ABCA1高表达组的胃癌主要以弥漫型为主，并有着更差的生存预后。Cox回归分析表明，ABCA1、P53、病理分级和M分期均影响胃癌患者的生存预后，其中病理分级和M分期是影响胃癌患者总生存预后的独立危险因素。这些结果大部分和ABCA1在TGCA-STAD队列以及GEO胃癌队列中研究结果相一致。 4.在体外水平，ABCA1的敲低显著抑制了胃癌细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭的能力，并能促进胃癌细胞的凋亡和引起胃癌细胞周期的阻滞。在体内水平，通过构建HGC-27细胞的裸鼠皮下移植瘤模型和转移瘤模型，进一步证实了ABCA1的敲低抑制了胃癌的生长和转移。 5.转录组测序分析发现，ABCA1敲低后引起了多种细胞功能和信号通路的改变，包括脂质代谢、免疫调节、炎症介质的调节、细胞生长的调节、MAPK信号通路、TNF-β信号通路、PI3K-AKT信号通路和JAK-STAT信号通路等。在TCGA-STAD队列中，ABCA1和TGF-β家族基因、AKT家族基因以及GSK3B均在胃癌中高表达，并且它们之间的表达呈显著正相关性。Westernblotting实验证明，ABCA1的敲低显著降低了胃癌细胞中TGF-β的表达水平、AKT的磷酸化水平和GSK3-β的表达水平。同时，ABCA1的敲低显著降低了胃癌细胞中N-cadherin和β-catenin的表达水平，但是促进了E-cadherin的表达水平。回复实验的结果证明，在ABCA1敲低的胃癌细胞中加入TGF-β激活剂，胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力又重新得到了回复。Westernblotting实验证明，在ABCA1敲低的胃癌细胞中加入TGF-β激活剂，TGF-β、p-AKT和p-GSK-3β的表达水平也明显得到了回复，而ABCA1的表达无明显的变化。 6.以ABCA1蛋白为作用靶点进行抑制剂的虚拟筛选，一共从72285个小分子化合物中筛选出了34个候选的小分子化合物。接着将排名前3的小分子化合物分别与ABCA1蛋白进行了分子对接，结果表明这3种小分子化合物都能稳定的和ABCA1蛋白结合并发挥抑制蛋白活性的作用。此外，我们进一步将这3个小分子化合物分别和ABCA1蛋白之间进行了分子动力学模拟，结果表明该模拟过程的稳定性较高，进一步验证了这3个小分子化合物和ABCA1蛋白的稳定结合。最后，通过体外实验进一步验证了Bractoppin的作用效果，结果表明Bractoppin能够抑制胃癌细胞的恶性表型，具有抗肿瘤活性。 结论： 1.胃癌中脂质代谢基因的表达和临床病理特征及预后密切相关，通过对胃癌脂质代谢分子亚型的鉴定和预后模型的构建，有助于对胃癌患者的分层管理和精准治疗方案的制定提供参考和依据； 2.ABCA1通过TGF-β/AKT/GSK3β信号通路参与了胃癌的进展，可能成为胃癌治疗的潜在靶点； 3．Bractoppin可能是靶向ABCA1蛋白的小分子抑制剂。
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