丝胶靶向Akt1调控糖酵解及氧化应激保护STZ致损伤INS-1细胞

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中文摘要：糖尿病是由多种病因引起的以慢性血糖升高为特点，涉及多系统损害的代谢性综合征，由胰岛素分泌减少和（或）作用缺陷引发。糖尿病患者中绝大部分为2型糖尿病。胰岛B细胞功能缺陷和胰岛素抵抗是2型糖尿病发生的两个重要病理生理机制，有效保护胰岛B细胞已成为2型糖尿病治疗的关键。胰岛B细胞葡萄糖代谢是胰岛素分泌调节的中心环节，糖酵解在葡萄糖代谢中占有一定比例，而胰岛B细胞糖酵解的变化是糖尿病时的一个关键代谢特征；另外，由于胰岛B细胞缺失谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶，使得其更易受到氧化应激的损伤。磷脂酰肌醇-3-激酶（Phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶（ProteinkinaseB，PKB，又称Akt）信号通路广泛存在于多种组织细胞，该通路活化后参与细胞存活、代谢和血糖稳态等多种生物学过程。蚕茧中的水溶性蛋白质-丝胶蛋白（丝胶）是天然蛋白质，由于它具有生物相容性、抗菌、抗凝、无毒副作用等特点日益受到学者们的关注。本课题组前期实验发现，丝胶能有效降低血糖，但具体作用机制需要深入研究。前期采用Label-free定量蛋白质组学结合生物信息学技术分析，预测丝胶发挥保护作用的靶点可能是Akt1。因此，本研究使用链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）作用大鼠胰岛素瘤细胞（Ratinsulinomacells，INS-1）细胞体外模拟糖尿病时胰岛B细胞损伤，并给予丝胶进行干预，观察丝胶能否通过PI3K/Akt信号通路调控糖酵解、氧化应激，从而发挥保护INS-1细胞的作用；本研究不仅能给糖尿病治疗提供新思路，还可解决大量丝胶废弃的问题，具有良好的应用前景。目的：通过观察PI3K/Akt信号通路、糖酵解、氧化应激相关指标的变化，探讨丝胶是否通过PI3K/Akt信号通路调控糖酵解、氧化应激，从而保护STZ致损伤INS-1细胞，并确定丝胶调控PI3K/Akt信号通路的靶点为Akt1。方法： 1Akt1抑制剂和激动剂浓度的确定 1.1Akt1抑制剂：根据本课题组前期实验，Akt1抑制剂A-674563的作用浓度为0.3μmol/L。 1.2Akt1激动剂：分别以0μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.6μmol/L、0.8μmol/L、1.0μmol/L的Akt1激动剂SC79，以及10mmol/L的STZ和600μg/ml的丝胶作用INS-1细胞，CCK-8法检测各组INS-1细胞的细胞活力，确定Akt1激动剂SC79的作用浓度为0.8μmol/L。 2INS-1细胞处理与分组将INS-1细胞随机分为5组，加入对应药物处理24h进行后续实验。对照组（不予任何药物处理）、模型组（10mmol/LSTZ处理细胞）、丝胶组（10mmol/LSTZ、600μg/ml丝胶共同处理细胞）、Akt1抑制剂组（10mmol/LSTZ、600μg/ml丝胶、0.3μmol/LA-674563共同处理细胞）、Akt1激动剂组（10mmol/LSTZ、600μg/ml丝胶、0.8μmol/LSC79共同处理细胞）。 3采用CCK-8法检测各组INS-1细胞活力 4采用实时荧光定量PCR（RealTimeQuantitative，RT-qPCR）法检测各组INS-1细胞PI3K，Akt，磷酸果糖激酶1（Phosphofructokinase-1，PFK1），磷酸果糖-2,6-二磷酸酶（6-phosphofructose-2,6-diphosphatase，PFKFB2），乳酸脱氢酶A（Lactatedehydrogenase，LDHA）mRNA的表达 5采用蛋白免疫印迹（Westernblotting，WB）法检测各组INS-1细胞PI3K，p-Akt1，PFK1，PFKFB2，LDHA蛋白的表达 6采用免疫荧光（Immunofluorescence，IF）染色检测各组INS-1细胞p-Akt1、PFK1、PFKFB2蛋白的表达 7采用酶联免疫吸附（Enzyme-linkedImmunosorbentassay，ELISA）法检测各组INS-1细胞总抗氧化物（Totalantioxidantcapacity，T-AOC）、过氧化氢酶（Catalase，CAT）、脂质过氧化物（Lipidperoxydase，LPO）、活性氧（Reactiveoxygespecies，ROS）的水平 8采用流式细胞术检测各组INS-1细胞凋亡率结果： 1丝胶对INS-1细胞活力的影响与对照组相比，模型组INS-1细胞活力显著降低（P＜0.05）；与模型组相比，丝胶组细胞活力显著升高（P＜0.05）；与丝胶组相比，Akt1抑制剂组细胞活力显著降低（P＜0.05），Akt1激动剂组细胞活力显著升高（P＜0.05）。 2丝胶对INS-1细胞PI3K、Akt/Akt1mRNA和蛋白表达的影响与对照组相比，模型组INS-1细胞PI3K，Akt/Akt1mRNA和蛋白的表达显著下降（P＜0.05）。与模型组相比，丝胶组INS-1细胞PI3K，Akt/Akt1mRNA和蛋白的表达显著增高（P＜0.05）。与丝胶组相比，Akt1抑制剂组、激动剂组INS-1细胞PI3KmRNA和蛋白的表达无明显差异（P＞0.05）。与丝胶组相比，Akt1抑制剂组INS-1细胞Akt/Akt1mRNA和蛋白的表达明显降低（P＜0.05），Akt1激动剂组INS-1细胞Akt/Akt1mRNA和蛋白的表达明显升高（P＜0.05）。 3丝胶对INS-1细胞糖酵解相关指标PFK1，PFKFB2，LDHAmRNA和蛋白表达的影响与对照组相比，模型组INS-1细胞PFK1，PFKFB2，LDHAmRNA和蛋白的表达显著下降（P＜0.05）。与模型组相比，丝胶组INS-1细胞PFK1，PFKFB2，LDHAmRNA和蛋白的表达显著增高（P＜0.05）。与丝胶组相比，Akt1抑制剂组PFK1，PFKFB2，LDHAmRNA和蛋白的表达明显降低（P＜0.05）；Akt1激动剂组PFK1mRNA的表达明显升高（P＜0.05），PFKFB2，LDHAmRNA的表达均有升高趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。与丝胶组相比，Akt1激动剂组LDHA蛋白的表达明显升高（P＜0.05），PFK1、PFKFB2蛋白的表达有升高趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。 4免疫荧光染色INS-1细胞p-Akt1、PFK1、PFKFB2蛋白的表达 INS-1细胞细胞核DAPI染色荧光信号为蓝色，p-Akt1、PFK1、PFKFB2蛋白荧光信号为绿色，位于INS-1细胞细胞质。模型组与对照组比较，p-Akt1、PFK1、PFKFB2蛋白的平均荧光强度显著下降（P＜0.05）。丝胶组与模型组比较，p-Akt1、PFK1、PFKFB2蛋白的平均荧光强度显著增强（P＜0.05）。Akt1抑制剂组与丝胶组比较p-Akt1、PFK1、PFKFB2蛋白的平均荧光强度显著下降（P＜0.05）。Akt1激动剂组与丝胶组比较，p-Akt1、PFK1的平均荧光强度显著增强（P＜0.05）；PFKFB2蛋白的平均荧光强度增强，但差异无统计学意义（P＞0.05）。 5丝胶对INS-1细胞氧化应激相关指标T-AOC、CAT、LPO、ROS的影响与对照组相比，模型组T-AOC、CAT含量显著下降，LPO、ROS水平显著升高（P＜0.05）。与模型组相比，丝胶组T-AOC、CAT含量显著升高，LPO、ROS水平显著降低（P＜0.05）。与丝胶组相比，Akt1抑制剂组T-AOC、CAT含量显著降低，LPO、ROS水平显著升高（P＜0.05）；Akt1激动剂组LPO水平显著降低（P＜0.05），T-AOC、CAT含量均有升高趋势，ROS水平有降低趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。 6丝胶对INS-1细胞凋亡率的影响与对照组相比，模型组INS-1细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）。与模型组相比，丝胶组INS-1细胞凋亡率明显降低（P＜0.05）。与丝胶组相比，Akt1抑制剂组INS-1细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）；Akt1激动剂组INS-1细胞凋亡率有下降趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：丝胶以Akt1为靶点调控PI3K/Akt信号通路，增强糖酵解改善INS-1细胞葡萄糖代谢，减轻氧化应激减少INS-1细胞凋亡，是丝胶对STZ致损伤INS-1细胞发挥作用的机制之一。

作者：

李雨欣

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关键词：

丝胶 2型糖尿病糖酵解氧化应激 INS-1细胞

授予学位：

硕士

学科专业：

基础医学;人体解剖与组织胚胎学

导师：

陈志宏

学位年度：

2024

学位授予单位：

承德医学院

语种：

中文

中图分类号：