摘要
实验一：为探究大口黑鲈（Micropterussalmoides）能量代谢的潜在机制，本研究将96条体态活力相似的鱼（初始体重：77.57±0.75g）随机分配到3个800L的养殖桶中，分别在饥饿0h（对照组）、12h、24h、48h、96h和192h时取样。该试验在循环水养殖系统中进行，每日换水量为10%，提供连续流动的曝气（溶解氧≥6mg/L）砂滤净水（2.0L/min）。水温和pH值分别保持在27±1℃和7.2±0.2。研究结果如下： 1、禁食不同时间对大口黑鲈常规指标的影响。 与对照组相比，大口黑鲈饥饿96h和192h导致其体重显著下降（P＜0.05）。与对照组相比，饥饿12h后肝体指数（HSI）显著下降（P＜0.05），饥饿24h后内脏指数（VSI）显著下降（P＜0.05）。禁食48h时肝脏水分含量相比于对照组显著降低（P＜0.05），但48h后又显著升高（P＜0.05）。粗脂肪含量（肝脏重（mg）×肝脏粗脂肪含量（%））显著下降（P＜0.05），二次方程为y=0.0007x2-0.2827x+49.402（R2=0.9446）。肝脏粗蛋白含量（肝脏重（g）×肝脏粗蛋白含量（%））也呈现显著下降趋势（P＜0.05），与上次摄食后小时数的二次关系为y=0.0013x2-0.5666x+165.31（R2=0.8643）。 2、禁食不同时间对大口黑鲈胰岛素样生长因子1（insulin-likegrowthfactor1,igf-1）与雷帕霉素的靶点(targetofrapamycin,TOR)通路相关基因相对表达的影响。 对照组igf-1、tor、核糖体蛋白S6（ribosomalprotein,s6）和激活转录因子4（activatingtranscriptionfactor4,atf4）的表达明显高于其他处理组（P＜0.05），192h组s6的表达显著低于12h、24h、48h和96h组（P＜0.05）。随着饥饿时间的增加，在96h和192h处理时真核起始因子2α（eukaryoticinitiationfactor2α,eif2α）的表达显著增加（P＜0.05）。与此同时，饥饿导致发育和DNA损伤反应调节1（regulatedindevelopmentandDNAdamageresponses1,redd1）的表达上调，在96h和192h时该基因表达水平显著高于其他处理组（P＜0.05）。 3、禁食不同时间对大口黑鲈脂肪代谢相关基因相对表达的影响。 饥饿导致脂肪酸合酶（fattyacidssynthase，fas）、乙酰辅酶A羧化酶1（acetyl-CoAcarboxylase1,acc1）、乙酰辅酶A羧化酶2（acetyl-CoAcarboxylase2,acc2）和酰基辅酶A氧化酶（acyl-CoAoxidase,aco）的表达呈下降趋势，饥饿192h时的表达量显著低于对照组（P＜0.05）。此外，饥饿增强了激素敏感性脂肪酶（hormone-sensitivelipase,hsl）和肉碱棕榈酰转移酶1（carnitinepalmitoyltransferaseI,cpt1）的基因表达。饥饿192h时hsl基因表达显著高于对照组（P＜0.05），cpt1在96h的表达显著高于对照组（P＜0.05）。在饥饿96h时，脂肪甘油三酯脂肪酶（adiposetriglyceridelipase，atgl）的表达显著高于其他处理组（P＜0.05）。 4、禁食不同时间对大口黑鲈糖异生和糖酵解相关基因相对表达的影响。 在糖酵解相关基因表达方面，相比于对照组，葡萄糖激酶（glucokinase,gk）、磷酸果糖激酶肝型丙酮酸激酶（phosphofructokinaselivertype,pfkl）和丙酮酸激酶（pyruvatekinas,pk）表达水平在饥饿12h时上调（P＜0.05），而在48h、96h和192h组中，表达呈下降趋势。在饥饿96h处理中，葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基（glucose-6-phosphatasecatalyticsubunit,g6pc）的表达水平显著高于其他处理组（P＜0.05），但在其他组中未观察到显著性。在糖异生相关基因表达方面，果糖-1,6-二磷酸酶-1（fructose-1,6-bisphosphatase-1,fbp1）的表达与pfkl和pk的趋势一致（P＜0.05）。同时，饥饿192h导致磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvatecarboxykinase,pepck）表达呈下降趋势，在12h和96h处理中与对照组相比其表达显著下降（P＜0.05）。 结论：综上，在饥饿过程中，糖原可以通过激活糖酵解和维持低表达水平的糖异生来参与能量调动，是大口黑鲈能量调控中不可缺少的物质。虽然饥饿也会激活脂肪分解，但大口黑鲈在短期饥饿期间主要使用肝糖原，这也产生了蛋白质节约作用。因此，饥饿期间肝脏糖原的消耗和肝脏糖异生的抑制可以消耗过量的糖原储存，有助于缓解饲料中高碳水化合物带来的肝脏损害。 实验二：肉食性鱼类是典型的“糖尿病患者”，其对饲料中的碳水化合物的利用能力有限，过量的碳水化合物会损害其健康。本研究进行了为期9周的养殖实验，以探究饲料中添加二甲双胍（MET）对大口黑鲈生长性能、糖代谢、抗氧化能力和细胞凋亡的影响。本实验正对照（低碳水化合物，LC）的饲料α淀粉含量为5%，负对照（高碳水化合物，HC）的饲料α淀粉含量为10%。其他3种等氮（49.98%）和等脂（9.74%）饲料分别在负对照的基础上，补充0.1%（HCM（0.10））、0.25%（HCM（0.25））和0.5%（HCM（0.50））MET。实验开始前选取450条形态活力相似的大口黑鲈（初始体重40±0.5g），随机分配到15个养殖桶（每个桶30条鱼）中。在养殖实验期间，每天8：00和16：00投喂两次。循坏水用海绵和珊瑚砂过滤，并用紫外线消毒，每天换水量为10%。养殖实验全程水质为：温度27±1℃，溶解氧≥6mg/L，氨氮浓度≤0.15mg/L，pH7.2±0.2。研究结果如下： 1、饲料中添加二甲双胍对大口黑鲈常规指标的影响。 HC组的最终体重（FBW）和比生长速率（SGR）显著低于LC组（P＜0.05）。与HC组相比，MET补充组的FBW和SGR显著增加（P＜0.05）。HC组HSI最高，随MET水平升高而降低，但差异不显著（P＞0.05）。LC组VSI水平最低，HCM（0.50）组VSI水平最高（P＜0.05）。高碳水化合物饲料中MET的加入也显著增加了FCR和PER（P＜0.05）。 2、二甲双胍的添加对大口黑鲈体组成的影响。 全鱼粗脂肪和水分含量在所有处理中均无统计学差异（P＞0.05）。全鱼粗蛋白含量随着MET的添加而增加（P＜0.05）。HC组全鱼的灰分含量显著高于LC组（P＜0.05）。此外，HCM（0.10）中肝脏的水分含量是最高水平，而LC组最低（P＜0.05）。HC组大口黑鲈肝脏粗蛋白含量显著低于LC组，同时，随着高碳水化合物饲料中MET含量的增加，肝脏粗蛋白质含量呈现上升趋势（P＜0.05）。大口黑鲈肝脏粗脂肪含量随MET的摄入量呈下降趋势，HC、HCM（0.25）组和HCM（0.50）组与LC组差异有统计学意义（P＜0.05）。HC组肝脏糖原含量显著升高，HCM组肝糖原水平下降（P＜0.05）。HC组肌肉含水量增加（P＜0.05）。HCM组肌肉粗蛋白含量显著升高后降低（P＜0.05）。 3、二甲双胍的添加对大口黑鲈血清酶活力的影响。 与LC组相比，HC组血清中葡萄糖（GLU）、总胆固醇（TC）、天冬氨酸转氨酶（AST）和甘油三酸酯（TG）含量显著升高，总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）和丙氨酸转氨酶（ALT）含量显著降低（P＜0.05）。和HE组相比，补充MET后，GLU、TC和AST含量显著降低，TG含量显著升高（P＜0.05）。与HC组相比，HCM（0.50）组的ALT显著降低（P＜0.05）。 4、二甲双胍的添加对大口黑鲈肝脏胰岛素通路相关基因表达的影响。 与LC组相比，HC组胰岛素受体底物1（insulinreceptorsubstrate1，irs1）、胰岛素受体a（insulinreceptora,ira）和胰岛素受体b（insulinreceptorb,irb）的相对表达显著降低（P＜0.05）。添加MET后，这些基因的表达显著高于HC组（P＜0.05）。HC组磷脂酰肌醇-3-激酶p85α（pi3kr1）的表达显著低于LC组（P＜0.05），在高碳水化合物饲料中添加MET可促进其表达（P＜0.05）。与HC组相比，HCM（0.50）组的丝氨酸/苏氨酸激酶1（akt1）表达水平显著提高（P＜0.05）。 5、二甲双胍的添加对大口黑鲈肝脏糖异生和糖酵解相关基因表达的影响。 LC组和HC组ADP依赖性葡萄糖激酶(ADPdependentglucokinase,adpgk)、pfkl和pk的相对表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。与HC组相比，HCM（0.25）和HCM（0.50）组adpgk和pfkl的基因表达显著增强（P＜0.05）。值得注意的是，HCM（0.25）和HCM（0.50）组adpgk、pfkl和pk基因的表达量甚至显著高于LC组（P＜0.05）。同时，LC组和HC组g6pc、fbp1和pepck的相对表达量差异无统计学差异（P＞0.05）。在HCM（0.25）组中观察到g6pc基因表达的最小值（P＜0.05）。此外，与LC组和HC组相比，HCM（0.10）组的pepck表达显著降低（P＜0.05）。 6、二甲双胍的添加对大口黑鲈肝脏抗氧化能力的影响。 在酶活水平上，HC组肝脏抗氧化能力（T-AOC）和总超氧化物歧化酶（T-SOD）水平显著低于LC组（P＜0.05）。添加MET后，与HC组相比，这些指标显著增强（P＜0.05）。 在转录水平上，与LC组相比，HC组过氧化氢酶（catalase，cat）、超氧化物歧化酶2（superoxidedismutase2，sod2）和核因子红细胞2相关因子2（nuclearfactorerythroid2-relatedfactor2，nrf2）的表达显著下调（P＜0.05）。与HC组相比，MET显著增强了这些基因的相对表达（P＜0.05）。此外，与LC组相比，HCM(0.25)和HCM(0.50)组nrf2和cat的基因表达显著上调（P＜0.05）。 7、二甲双胍的添加对大口黑鲈肝脏细胞凋亡相关基因表达的影响。 与LC组相比，HC组b细胞淋巴瘤-2（b-celllymphoma-2,bcl2）和细胞凋亡诱导因子3(apoptosisinducingfactor3,aif3)的表达显著升高，bcl2相关x（bcl2-associatedx,bax）、细胞凋亡相关蛋白（apoptosisrelatedprotein3,apr3）、细胞凋亡刺激蛋白p532（apoptosisstimulatingproteinofp532,aspp2）、抗细胞凋亡e3泛素蛋白连接酶1（apoptosisresistante3ubiquitinproteinligase1,arel1）、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumornecrosisfactorrelatedapoptosisinducingligand,trail）、活化T细胞核因子（nuclearfactorofactivatedtcells1,nfaci-l）和细胞凋亡诱导因子2(apoptosisinducingfactor2,aif2)的表达显著降低（P＜0.05）。与HC组相比，MET补充降低了bcl2的表达，增加了bax、apr3、aspp2、arel1、trail、nfac1-l、aif3和aif2的表达（P＜0.05）。HCM（0.25）组apr3表达最高（P＜0.05）。HCM（0.10）组中arel1和aif3的表达最高（P＜0.05）。 8、Hamp;E染色结果。 Hamp;E染色结果显示，饲喂高碳水化合物饲料组的肝细胞出现肝细胞空泡化和肝细胞核向细胞边缘移位的情况，提示其肝脏出现了损伤。在LC组和HCM(0.50)组的肝细胞中未发现上述现象。 结论：结果显示高糖饲料中加入二甲双胍显著减少了肝糖原的积累和血清葡萄糖含量的降低，部分原因是胰岛素和葡萄糖活化糖代谢途径。此外，二甲双胍增强了高碳水化合物饲料的大口黑鲈的抗氧化能力，激活了细胞凋亡。
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