摘要
研究背景 骨质疏松症是运动系统退行性疾病之一，与增龄关系密切；随着国家人口逐渐老龄化，骨质疏松症成为了全球范围内的重大医疗卫生挑战。目前在骨质疏松症病因研究中，骨质疏松症的危险或保护基因层出不穷，极大地丰富了我们对骨质疏松症复杂发生机制的理解。在一项人骨组织蛋白的预实验中，本研究发现人骨组织中膜铁转运蛋白（Ferroportin，FPN）的表达量可能与骨密度高低有关。FPN是细胞膜上的跨膜蛋白，也是细胞膜上主要的“铁输出通道蛋白”。而FPN与骨代谢的相关研究主要集中在FPN促进破骨细胞活性与分化能力方面，FPN对成骨细胞的影响和机制尚不明晰。斑马鱼作为美国国立卫生研究院（NIH）认定的第三大重要实验动物模型，具有：①繁殖能力强；②信号通路与人类基本近似；③体表透明，表型易观察；④早期发育过程中，成骨细胞功能远远大于破骨细胞功能等特点，是研究成骨细胞功能的良好动物模型。结合本研究组先前fpn突变体斑马鱼成骨功能减弱的初期表型，本研究决定在斑马鱼模型上进行fpn对成骨细胞骨形成的影响和机制研究。 研究目的 本研究首先收集人骨组织样本和人血液样本进行重复验证实验，验证人体内FPN蛋白表达水平与骨密度之间的关联。接着从临床结果出发，本研究构建了fpn基因敲除斑马鱼，分析比对fpn-/-斑马鱼与突变体斑马鱼一般表型的一致性，验证基因敲除斑马鱼是否成功构建。进一步研究发现，fpn敲除对成骨细胞功能的抑制不仅仅是铁代谢改变引起的，为此本研究通过转录组学分析、双荧光素酶报告实验探索fpn抑制成骨细胞功能的铁代谢以外的可能机制，最终在人成骨细胞上验证该可能机制的可重复性，为与FPN相关的骨质疏松症的筛查和防治提供新的方法和理论依据。 研究方法 1.为FPN蛋白表达水平与骨密度之间的关联性，本研究采取以下方法： （1）本研究收集2020-2021年间于我院因髋部骨折行髋关节置换手术的绝经后女性患者的基础临床指标；髋关节置换术中取下的股骨头组织立即进行相关处理并予以合适方法储存。经筛选最终纳入16例绝经后女性患者。提取患者股骨头股骨颈部位松质骨进行蛋白提取，通过Westernblot检测FPN蛋白水平的高低，在进行灰度值量化后与股骨颈骨密度进行相关性分析。 （2）本研究搜集2020年～2021年间于我院行健康体检的绝经后女性的全血样本。同时还搜集了所有患者的双能x线检测的骨密度信息、血清铁蛋白资料。经筛选最终入组22例绝经后体检女性患者，提取血细胞膜蛋白，进行ELISA检测FPN蛋白水平，并与对应患者股骨颈骨密度进行相关性分析。 2.为成功构建fpn基因敲除斑马鱼，本研究采取以下实验方法： （1）在斑马鱼fpn第2个外显子上面设计靶位点，并在体外合成gRNA（100pg），之后和Cas9-Capped-mRNA一起在单细胞时期显微注射到斑马鱼胚胎中。 （2）初代胚胎（F0）饲养至成年，和野生型斑马鱼交配，得到F1胚胎并饲养至成年，通过对F1成鱼进行剪尾测序鉴定，找出F1代中的杂合子。将相同杂交组合的F1代相互交配得到F2胚胎，得到的F2代胚胎即可用作后续研究分析。 （3）对WT、fpn+/-和fpn-/-幼鱼收样，观察三组一般生长情况以及存活情况，进行O-Dianisidine染色检测血红蛋白含量；取血进行涂片，经过瑞氏染色观察红细胞形态；通过组织压片后二价铁染色观察组织铁含量变化。 3.为验证fpn基因敲除对骨代谢尤其是成骨功能的影响，本研究采取以下方法： （1）收集WT、fpn+/-和fpn-/-三组幼鱼，3-5dpf时进行阿尔新蓝软骨染色，观察软骨发育情况；6-7dpf时①通过茜素红硬骨染色，观察早期骨矿化情况；②通过与Tg(sp7-EGFP)杂交的后代观察早期成骨细胞的数目与成骨情况；8dpf时通过TRAP染色观察破骨细胞数目；7dpf时提取总RNA，荧光定量PCR检测成骨、破骨相关基因表达情况。 （2）对fpn-/-72hpf幼鱼进行INFeD显微注射，通过血红蛋白染色观察贫血表型的恢复；通过FerroOrange铁离子探针染色观察成骨细胞内铁离子浓度变化情况。 （3）对fpn-/-72hpf幼鱼进行INFeD显微注射后，收集WT、fpn-/-和fpn-/-＋INFeD三组幼鱼，6-7dpf时①通过茜素红硬骨染色，观察早期骨矿化恢复情况；②通过与Tg(sp7-EGFP)杂交的后代观察早期成骨细胞的数目与成骨情况；8dpf时通过TRAP染色观察破骨细胞数目变化情况；7dpf时提取总RNA，荧光定量PCR检测成骨、破骨相关因表达情况。 4.为探究fpn基因敲除影响成骨功能的机制，本研究采取了以下方法： (1)提取WT、fpn-/-幼鱼总RNA，进行高通量转录组测序，通过差异基因分析、GO富集分析、KEGG通路分析寻找fpn基因敲除影响成骨功能的可能机制。 (2)筛选可能通路基因构建报告基因质粒，通过双荧光素酶报告实验，检测并筛选出与铁代谢相关的通路基因。 (3)使用PPARγ抑制剂GW9662处理显微注射INFeD后的fpn-/-幼鱼，收集WT、fpn-/-＋INFeD和fpn-/-＋INFeD+GW三组幼鱼，7dpf时通过茜素红硬骨染色，观察早期骨矿化恢复情况；7dpf时提取总RNA，荧光定量PCR检测成骨、破骨相关基因表达情况。 (4)在人成骨细胞Saos-2上敲降FPN，同样使用PPARγ抑制剂GW9662处理，对WT、si-FPN＋INFeD和si-FPN＋INFeD+GW三组成骨细胞进行成骨诱导12天后，①茜素红染色观察骨矿化情况；②提取总RNA，荧光定量PCR检测成骨相关基因表达情况。分析斑马鱼上的机制通路在人源细胞上的可重复性。 研究结果 1.总体水平上，骨质疏松组FPN的相对表达水平较非骨质疏松组下降，差异有统计学差异。在血清铁蛋白Fer≤150μg/L时，FPN蛋白表达量均与股骨颈骨密度呈正相关；而在血清铁蛋白Fer≥150μg/L时，FPN蛋白水平保持在一个高水平，约100ng/mL，与股骨颈骨密度无相关性。在血清铁蛋白Fer≤150μg/L时，Hepcidin蛋白水平与股骨颈骨密度同样一定程度上呈正相关；而在血清铁蛋白Fer≥150μg/L时，Hepcidin蛋白水平保持在一个高水平，约30ng/mL，与股骨颈骨密度无相关性。 2.PCR电泳结果提示fpn基因敲除成功；fpn基因对斑马鱼体节增长影响不大对斑马鱼游囊的发育影响较大；fpn-/-幼鱼在12dpf全部死亡，fpn+/-和WT幼鱼均可存活，这与已有研究结果一致；fpn-/-幼鱼血红蛋白由于缺乏铁剂的补充而生成受阻；成熟红细胞形成减少，组织压片进行的铁染色显示fpn-/-幼鱼体细胞内的浅蓝色铁染色减少。以上结果与已有研究现象一致，提示fpn基因敲除斑马鱼构建成功。 3.在3-5dpf的软骨发育全期，三组幼鱼的颅内下颌长度（LJL）、角舌骨长度（CCL）以及颅内距（ICD）均无明显差异。与WT斑马鱼相比，fpn-/-斑马鱼矿化面积减少接近70%，成骨特异荧光强度也明显降低，提示成骨细胞减少、矿化能力减弱。与成骨细胞减少的现象相反，fpn-/-幼鱼的TRAP阳性区域较WT组增大，提示破骨细胞形成增多。在注射INFeD后，fpn-/-幼鱼的血红蛋白恢复至正常，成骨细胞内铁离子水平恢复，而骨矿化结果未完全恢复，破骨细胞有所降低。荧光定量PCR结果提示，fpn-/-的成骨相关基因runx2a、sp7、bglap、alp的mRNA水平均较WT下降，破骨相关基因acp5a的mRNA水平升高，ctsk的mRNA无明显差异。而在给fpn-/-幼鱼注射INFeD后，runx2a、sp7的mRNA水平较fpn-/-组未恢复，bglap、alp的mRNA水平均较fpn-/-组明显恢复，破骨相关基因acp5a、ctsk的mRNA水平均升高。 4.fpn-/-组相较于WT组，在糖类代谢、甘油酯代谢、Ferroptosis信号通路、PPAR信号通路等信号通路存在明显变化；双荧光素酶结果提示，糖类代谢、甘油酯代谢Ferroptosis通路等能量代谢通路以及破骨基因acp5b与铁代谢相关，而runx2a与铁代谢无关。使用PPARγ抑制剂后可以部分恢复runx2a表达，而这一机制在人成骨细胞中得到重复验证。 研究结论 1．通过人骨组织蛋白免疫印迹实验以及血细胞样本蛋白ELISA实验，验证了FPN蛋白表达水平一定条件下与髋部股骨颈骨密度的相关性，FPN蛋白水平越高，股骨颈骨密度越高。 2.fpn-/-斑马鱼早期一般指标除了游囊发育延迟外，其余的基础表型与已有fpn突变体表型一致。 3.fpn基因敲除抑制斑马鱼成骨功能，促进破骨功能。在排除fpn基因敲除导致摄入铁不足性的贫血后，fpn-/-斑马鱼成骨表型未完全恢复，提示可能存在铁以外的因素影响成骨功能。 4.RNA-seq数据表明能量代谢以及PPAR相关通路富集，结合双荧光素酶报告实验、斑马鱼和人成骨细胞上抑制PPARγ后成骨功能检测结果，推测fpn影响成骨细胞骨骨形成的可能机制为：fpn降低一方面使得细胞能量代谢紊乱，成骨细胞正常生命活动受到抑制；另一方面，通过升高的PPARγ抑制了成骨转录因子runx2a的表达，最终导致成骨功能下降，骨量降低。
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