摘要
褐藻胶寡糖（alginateoligosaccharides，AOS）是由褐藻胶降解得到的含有2~10个单糖的线性低分子量聚合物。褐藻胶裂解酶可用于定向制备具有不同聚合度（degreeofpolymerization，DP）的不饱和褐藻胶寡糖（unsaturatedalginateoligosaccharides，UAOS），具有酶解效率高、产物生物活性强、底物特异性高等优点，已成为继化学降解后更为有效的研究手段。目前已表征的褐藻胶裂解酶存在酶活性低、热稳定性差等问题，难以满足工业上定向制备褐藻胶寡糖的要求。本研究利用大肠杆菌异源表达的方法对前期获得的褐藻胶裂解酶基因进行表达，并分析其酶学性质，通过理性设计策略提高其热稳定性，通过同源比对和定向改造探究氨基酸/氨基酸序列对酶解产物的影响。主要研究结果如下： (1)将实验室前期获得的褐藻胶裂解酶基因与载体质粒pProEX-HTa连接并转入大肠杆菌，成功表达出分泌型褐藻胶裂解酶，将其命名为AlyMc。褐藻胶裂解酶AlyMc具有G偏好性，其最适温度为50℃，最适pH为7.0；AlyMc的胞内酶活力为361.17U/mL，比酶活力为2421.12U/mg；金属离子和化学试剂对酶活性的研究结果表明，Fe2+对褐藻胶裂解酶AlyMc酶活力有促进作用，且当浓度为5mM时，可以使酶活性增加40%左右；Na+、K+和Li+对褐藻胶裂解酶AlyMc酶活力无明显影响，Al3+、Ca2+、Mg2+和EDTA对AlyMc酶活力有抑制作用，且抑制作用随浓度的升高而增强；酶动力学结果显示，AlyMc的酶动力学参数Km为4.43mL/mg；Vmax为0.7mg/min·mL。 (2)以褐藻胶裂解酶AlyMc为研究对象，用HotspotWizard3.0和PoPMuSiC软件预测褐藻胶裂解酶AlyMc所有潜在的热稳定性突变位点，综合分析排除保守氨基酸以及位于催化位点5?范围内的氨基酸，筛选得到具有酶活力的12个突变体，其中突变体N149E、K159Q和N149M的细胞外及细胞内酶活力均高于褐藻胶裂解酶AlyMc。得到两个热稳定性明显提高的突变体Q246V和K249V，突变体Q246V和K249V的t1/2,50℃分别为3.85和3.65h，是AlyMc的1.63和1.55倍；突变体Q246V和K249V的比酶活力分别为5833.33U/mg和7174.48U/mg，是AlyMc的2.41和2.96倍。利用薄层层析色谱和高效液相色谱分析褐藻胶裂解酶AlyMc及其突变体Q246V和K249V降解褐藻胶的产物组成，结果表明AlyMc、突变体Q246V和K249V降解褐藻胶生成以DP2~5为主的褐藻胶寡糖，且其中四糖含量最为丰富。 (3)通过同源比对法挖掘褐藻胶裂解酶AlyMc的特殊氨基酸/氨基酸序列，探究其对酶解产物的影响，利用定点突变成功获得了4个突变体（T71F、84R-90A、106A-111A和106A-116D），并获得了具有酶活力的突变体T71F。利用高效液相色谱、薄层层析色谱和核磁共振光谱分析褐藻胶裂解酶AlyMc及突变体T71F的酶解产物，AlyMc降解polyG的终产物为DP2~4的不饱和褐藻胶寡糖，降解褐藻胶和polyM的终产物为DP2~5的不饱和褐藻胶寡糖；T71F降解褐藻胶、polyG和polyM的终产物均为DP2~5的不饱和褐藻胶寡糖，表明重组酶AlyMc及T71F为内切型褐藻胶裂解酶。利用1H-NMR进一步分析T71F的底物偏好性，结果表明T71F没有改变底物偏好性，但增加了对polyM的亲和性。TLC结果表明，重组酶AlyMc降解G5和G6的产物组成有所差异，降解G5的产物主要是二糖和三糖，而降解G6的产物是二糖、三糖和四糖。
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