摘要
研究背景及目的： 肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，占据肿瘤发病率的第二位，高居肿瘤相关死亡首位。在我国，肺癌的发病率和死亡率逐年攀升。根据肿瘤组织学分型，肺癌分为小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）两大类。肺腺癌是最常见的非小细胞肺癌，约占肺癌患者总数的40%。几十年来，肺腺癌的治疗方法层出不穷，然而患者的预后改善并不理想。因此，深入探究影响肺腺癌进展的分子机制，将有助于发现新的分子靶点，为肿瘤的精确诊断和靶向治疗奠定理论基础。 LncRNA是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA。通过与DNA、RNA和蛋白质相互作用，在多种生理病理过程中发挥重要调控作用。近年来，随着核糖体分析技术的发展和基于质谱的蛋白质组学的广泛应用，具有小型开放阅读框（sORF）且能够编码功能性微肽的LncRNA逐渐被发现。在肺腺癌中，LncRNA同样发挥着重要功能，那么肺腺癌中LncRNA能否编码微肽，编码的微肽是否影响肿瘤进程，尚知之甚少。 因此，本研究的目的在于探究肺腺癌中具有编码功能的LncRNA，深入探讨编码微肽在肺腺癌进展中的作用及其内在机制。 研究方法： （1）分析肺腺癌GEO表达谱芯片以及核糖体结合LncRNA数据，确定候选LncRNA；TCGA数据库分析候选LncRNA表达及与预后的关系，确定最终研究对象LINC00467。（2）通过ORFfinder网站分析LINC00467序列，筛选小型开放阅读框（sORF）；构建sORF质粒，在HEK-293T细胞中验证微肽外源性表达能力及起始密码子功能；构建特异性抗体验证微肽内源性表达；免疫荧光及核质分离实验探究微肽的亚细胞定位。（3）构建稳定过表达及稳定敲低微肽表达的细胞株；通过CCK-8、EdU、集落形成和流式细胞检测等一系列细胞功能学实验检测微肽对肺腺癌进展的影响；构建裸鼠皮下成瘤模型，体内验证微肽对肺腺癌进展的影响。（4）采用免疫共沉淀结合质谱分析方法，鉴定与微肽结合的功能蛋白分子；利用免疫荧光实验对微肽及其结合的蛋白分子进行共定位检测；在HEK-293T细胞及肺腺癌细胞中，通过免疫沉淀确定两者的结合；确定微肽通过结合互作蛋白发挥作用；通过WesternBlot及qRT-PCR实验探究两者结合对彼此表达的影响；细胞免疫荧光实验研究两者结合是否影响定位；核糖体测序探究微肽对蛋白翻译效率的影响。（5）通过WesternBlot检测微肽在肺腺癌临床标本中的表达，分析微肽表达水平与一系列临床病理因素之间的关系。 研究结果： （1）肺腺癌中LINC00467可以内源性表达一个94个氨基酸的微肽，将其命名为467MP（LINC00467-encodedmicropeptide），该微肽分布于细胞核及细胞质中。（2）过表达467MP可以促进肺腺癌细胞的增殖，抑制顺铂诱导的细胞凋亡；下调467MP的表达能够抑制肺腺癌细胞增殖，增强顺铂对细胞的杀伤作用。（3）467MP可以结合真核生物翻译延长因子1A1（EEF1A1）；467MP通过结合EEF1A1，影响肺腺癌细胞增殖及顺铂诱导的细胞凋亡。（4）核糖体测序发现467MP能够影响代谢相关基因的翻译。（5）在肺腺癌临床标本中，467MP在肿瘤组织中表达高于癌旁组织，其高表达与肿瘤大小，淋巴结转移和不良的临床分期相关。 研究结论： LINC00467能够编码包含有94个氨基酸的微肽467MP，该微肽在肺腺癌组织中表达增高，且与患者恶性临床特征相关。同时，467MP能够通过结合真核生物翻译延长因子1A1（EEF1A1），影响基因翻译效率，促进肺腺癌的进展。因此，467MP可能成为肺腺癌的生物学标志物和治疗新靶点。
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