摘要
近年来研究发现，microRNA（miRNA）在肝脏糖代谢过程中起着重要调控作用。本研究以miR-185-5p为研究靶点，利用动物模型和细胞模型，明确了miR-185-5p在肝脏糖异生生理学调控中的作用及其机制，并探讨了miR-185-5p在二甲双胍抑制肝脏糖异生中的介导作用。 第一部分miR-185-5p在肝脏糖异生调控中的作用及其机制 目的：探索参与调控糖异生的miRNA及其调控机制。 方法：1.调节肝脏糖异生关键miRNA的筛选和验证：健康小鼠在正常进食或饥饿处理后，取肝脏组织行RT-PCR和miRNA高通量测序，筛选表达变化显著且与代谢相关的miR-185-5p；以RT-PCR技术分析miR-185-5p的组织差异性分布以及肝脏糖异生关键基因PGC-1a、PEPCK、G6Pase的表达变化，并进行两者的相关性分析；构建HFD、db/db糖尿病小鼠模型，取其血清和肝脏组织，利用RT-PCR分析miR-185-5p在糖尿病小鼠模型中的变化规律，并和糖异生关键基因进行相关性分析；在2型糖尿病人群中，对血清miR-185-5p水平和空腹血糖进行相关性分析。 2.miR-185-5p靶向调节糖异生关键基因的筛选和验证：利用锁核苷酸技术（LNA）抑制小鼠体内miR-185-5p的转录，再行血糖监测、糖耐量试验、胰岛素耐量试验和丙酮酸耐量试验，同时以RT-PCR技术进一步遴选miR-185-5p靶向的糖异生关键基因；利用反义核苷酸和腺病毒过表达技术下调和上调小鼠原代肝细胞中miR-185-5p的水平，应用RT-PCR和Westernblot技术检测miR-185-5p靶向的糖异生关键基因G6Pase；以db/db小鼠为动物模型，利用腺病毒过表达miR-185-5p，再行血糖监测、糖耐量试验和丙酮酸耐量试验，并利用RT-PCR和Westernblot检测糖异生关键基因G6Pase的变化。 3.miR-185-5p靶向调节糖异生关键基因G6Pase的作用位点筛选和验证：以HEK293T细胞为载体，利用miR-185-5p模拟物及其抑制物，检测含有G6Pase3’-UTR的荧光素酶报告基因系统的活性变化。 4.血糖调节激素对miR-185-5p表达的影响及其转录调控机制：以地塞米松、胰高血糖素和胰岛素处理小鼠原代肝细胞和肝癌细胞株Hepa1-6，利用RT-PCR技术检测这些激素对miR-185-5p表达的直接影响；同时利用miR-185-5p抑制物及腺病毒过表达miR-185-5p技术，以RT-PCR方法检测经胰高血糖素和糖皮质激素共同刺激后肝细胞内miR-185-5p和G6Pase的变化规律。在上述细胞中构建FOXO1腺病毒过表达和shRNA干扰体系，在胰岛素或糖皮质激素刺激后，以RT-PCR技术检测肝细胞内miR-185-5p的变化；构建含野生型和突变型miR-185-5p启动子序列的荧光素酶报告基因系统，在胰岛素或糖皮质激素刺激下，以观察荧光素酶活性变化和染色质免疫共沉淀技术分析FOXO1对miR-185-5p转录调控的直接作用位点。 结果：1.调节肝脏糖异生关键性miRNA的筛选和验证：饥饿状态的健康C57BL/6雄性小鼠肝脏组织中，miR-185-5p表达显著下调，糖异生关键基因PGC-1a、PEPCK和G6Pase的表达显著上调。在2型糖尿病患者的血液中，也观察到miR-185-5p水平下降和空腹血糖上升。 2.miR-185-5p靶向调节糖异生关键基因的筛选和验证：使用锁核苷酸技术（LNA）敲低小鼠miR-185-5p表达后，小鼠肝脏内糖异生关键基因G6Pase的表达显著升高，肝糖生成增加，而PGC-1a和PEPCK表达无显著改变。 3.miR-185-5p靶向调节糖异生关键基因G6Pase的作用位点筛选和验证：在HEK293T细胞中miR-185-5p模拟物可以抑制G6Pase3’-UTR的活性，而miR-185-5p反义核苷酸则上调其表达活性，G6Pase3’-UTR特异性miR-185-5p靶位点突变消除了miR-185-5p依赖性G6Pase表达调控。miR-185-5p反义核苷酸转染MPH细胞后，上调了G6Pase表达；过表达miR-185-5p腺病毒则下调了MPH的G6Pase表达；动物模型实验中，注射过表达miR-185-5p腺病毒的实验组小鼠在第4天、第6天的空腹血糖均显著降低，葡萄糖耐量（GTT）、丙酮酸耐量（PTT）增加。 4.血糖调节激素对miR-185-5p表达的影响及其转录调控机制：在MPH和Hepa1-6中，地塞米松显著降低miR-185-5p的表达，胰岛素显著上调miR-185-5p的表达，而胰高血糖素不影响其表达。利用腺病毒过表达FOXO1后，MPH中miR-185-5p的表达显著降低；相反，干扰MPH内源性FOXO1表达后，miR-185-5p的表达明显增加。FOXO1结合位点的点突变完全阻断了地塞米松和胰岛素的调节作用。染色质免疫共沉淀实验证实了FOXO1可直接结合miR-185-5p启动子区域，且地塞米松促进该结合作用，而胰岛素则抑制其结合。 结论：miR-185-5p主要在肝脏中表达，其血浆浓度可特异性反映其肝脏表达量的变化；在糖异生调节过程中，它可靶向结合糖异生关键基因G6Pase3’-UTR特异序列抑制其转录，从而实现对肝脏糖异生的直接抑制作用；糖皮质激素和胰岛素则通过FOXO1与miR-185-5p启动子上相应的反应元件的结合实现其直接的调控作用，进而影响肝脏糖异生。 第二部分miR-185-5p在二甲双胍抑制肝脏糖异生中的介导作用 目的：探讨二甲双胍对糖异生的调控是否依赖于miR-185-5p。 方法：1.二甲双胍与miR-185-5p在肝糖异生过程中的直接联系：在健康小鼠和肝细胞，以及db/db糖尿病小鼠模型中，以二甲双胍进行干预，监测血糖变化，并利用RT-PCR和Westernblot技术测定miR-185-5p和糖异生关键基因的表达。 2.二甲双胍依赖于miR-185-5p抑制肝糖异生的作用机制：在肝细胞模型中，以miR-185-5p反义核苷酸合并二甲双胍进行干预；同时在糖尿病小鼠模型中，通过尾静脉注射miR-185-5pLNA，行葡萄糖耐量和丙酮酸耐量试验，并利用RT-PCR和Westernblot技术测定miR-185-5p和糖异生关键基因的表达。 结果：1.二甲双胍与miR-185-5p在肝糖异生过程中的直接联系：同对照组小鼠或肝细胞相比，二甲双胍干预组miR-185-5p表达显著升高；且db/db小鼠呈现明显的空腹血糖降低，miR-185-5p表达升高并伴随其靶基因G6Pase表达显著下调。 2.二甲双胍依赖于miR-185-5p抑制肝糖异生的作用机制：同对照组肝细胞相比，使用miR-185-5p反义核苷酸干预后，二甲双胍不能直接抑制G6Pase的表达，而对糖异生关键基因PEPCK的表达则仍有显著抑制作用；利用锁核苷酸技术敲低db/db小鼠肝脏中miR-185-5p的表达后，二甲双胍抑制肝糖异生和肝糖输出的重要作用被明显削弱。 结论：二甲双胍降低空腹血糖、抑制肝脏糖异生的作用，部分依赖于miR-185-5p。 总之，本研究发现了miR-185-5p通过靶向结合G6Pase3’-UTR抑制肝脏糖异生和减轻高血糖的作用机制。同时，也进一步确认了miR-185-5p/G6Pase通路介导了二甲双胍对肝脏糖异生的抑制作用。因此，miR-185-5p可能是治疗肝脏糖异生过量和空腹高血糖症的治疗靶点。
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