摘要
慢性疼痛是一个重要的公共卫生问题，它影响了全球30%以上的人口，造成了巨大的个人和社会经济负担。经典的阿片类药物吗啡是治疗慢性中重度疼痛的黄金标准用药，目前没有一种新药能够取代阿片类药物在治疗严重疼痛中的地位，长期重复使用会出现严重的副作用——吗啡耐受（morphinetolerance），但吗啡耐受产生的潜在机制尚未完全了解。生物机体是一个动态的、多因素综合调控的复杂体系，在从基因到性状的生物信息传递链中，机体需要通过不断调节自身复杂的代谢网络来维持系统内部与外部环境的正常动态平衡，代谢物是基因转录和翻译过程的下游分子，与疾病表型密切相关，是生物体系生理和生化功能状态的直接体现。因此，从代谢角度探讨吗啡耐受的发病机制，或可为吗啡耐受基础研究打开新的视角，为疼痛治疗提供新的干预靶点。 第一部分基于代谢组学技术探讨胆汁酸代谢稳态失调与小鼠吗啡耐受的相关性及机制 目的： 本研究利用代谢组学方法，阐明小鼠吗啡耐受状态下胆汁酸（Bileacid，BAs）稳态失衡的具体特征，进而研究小鼠吗啡耐受后胆汁酸代谢紊乱引起肠道微生物群的变化，及肝脏、小肠和脊髓等组织中与胆汁酸代谢合成相关的关键酶和胆汁酸转运蛋白的基因表达情况，并探究代谢物发生变化的可能机制。 方法: 8-10周龄的C57BL/6小鼠，颈部皮下注射吗啡10mg/kg，连续给药10天，对照组给予等体积的生理盐水。模型建立后，无菌条件下取对照组和吗啡耐受组小鼠肝脏、脊髓和DRG，眼球取血法收集小鼠外周血并分离血清。 （1）运用非靶向代谢组学技术无偏向筛选吗啡耐受小鼠外周血清代谢产物的含量变化； （2）并运用LC-MS靶向胆汁酸代谢组学进一步检测吗啡耐受小鼠外周血、肝脏和脊髓中各种胆汁酸的含量变化； （3）为明确吗啡耐受引起小鼠体内胆汁酸稳态失衡的可能机制，运用16SrRNA高通量技术检测吗啡耐受小鼠中与胆汁酸代谢相关的肠道菌群的变化特征； （4）使用qPCR检测吗啡耐受小鼠肝脏、小肠和脊髓等组织中与胆汁酸代谢合成相关的关键酶、胆汁酸转运蛋白和胆汁酸受体，及脊髓和背根神经节（DRG）中趋化因子、炎症因子基因表达情况。 结果： （1）非靶代谢组学分析显示，吗啡耐受小鼠血清中变化最大的前25条代谢通路中包含吗啡成瘾、酪氨酸代谢、柠檬酸循环、胰高血糖素信号通路、mTOR信号通路以及胆汁分泌等代谢通路； （2）靶向胆汁酸代谢组学分析显示，与对照组相比，吗啡耐受小鼠血清中脱氧胆酸（DCA）、鹅去氧胆酸（CDCA）含量显著降低； （3）16SrRNA测序结果显示，吗啡耐受小鼠的肠道中菌群的微生态失调，和胆汁酸生成相关的微生物乳酸杆菌科、拟杆菌属、大肠埃希菌和丹毒梭菌的丰度显著降低； （4）qPCR分析表明，吗啡耐受组小鼠肝脏中胆汁酸合成酶HmgcrmRNA显著升高，Hsd3b7mRNA显著降低，转运蛋白OstβmRNA显著增加，Oatp1和BespmRNA显著降低。吗啡耐受小鼠脊髓中Pparα的mRNA水平显著增加，S1pr2和Gr的mRNA水平显著降低。此外，吗啡耐受小鼠小肠组织中一些胆汁酸合成/转运相关酶及胆汁酸受体的表达亦发生了显著变化。 小结：吗啡耐受可导致小鼠血清胆酸稳态失衡以及肠道菌群的失调。 第二部分干预胆汁酸代谢调控小鼠吗啡耐受的作用及机制 目的： 补充牛磺酸脱氧胆酸（TUDCA）和脱氧胆酸（DCA）或结扎胆管（BDL）干预小鼠胆汁酸代谢，观察对吗啡耐受行为学的作用，检测胆汁酸干预后肠道菌群的变化及对吗啡诱导便秘的影响。 方法： （1）采用8-10周龄的C57BL/6小鼠建立吗啡耐受模型，通过腹腔注射TUDCA（100mg/kg和250mg/kg），灌胃给予TUDCA（250mg/kg和500mg/kg）干预胆汁酸的代谢，检测吗啡耐受小鼠的行为学变化及便秘情况； （2）通过小鼠灌胃DCA（25mg/kg和50mg/kg）处理干预胆汁酸代谢，检测吗啡耐受小鼠的行为学变化及便秘情况； （3）在胆管结扎（BDL）小鼠建立吗啡耐受模型，检测内源性升高胆汁酸后吗啡耐受小鼠的行为学变化； （4）应用TGR5基因敲除小鼠建立吗啡耐受模型，灌胃给予胆汁酸TUDCA（250mg/kg）和DCA（50mg/kg）处理，检测吗啡耐受小鼠的行为学变化及便秘情况； （5）16SrRNA检测TUDCA灌胃处理后吗啡耐受小鼠肠道菌群变化。 结果： （1）TUDCA（250mg/kg）腹腔注射组小鼠，与吗啡耐受组相比，甩尾实验从第6天开始、热板实验在第2天以及第8-10天开始，TUDCA显著减缓了小鼠的热痛行为学潜伏期下降，TUDCA（250和500mg/kg）灌胃在甩尾实验第5天和热板实验第4天开始同样显著缓解小鼠的吗啡耐受； （2）与吗啡耐受模型组小鼠比较，DCA（25mg/kg，50mg/kg）干预的小鼠可在甩尾实验和热板实验第7天开始显著增强吗啡的镇痛作用； （3）小鼠BDL在甩尾实验120min和热板实验30min开始显著增强了吗啡急性镇痛作用。同样在连续10天的吗啡耐受实验中，在甩尾实验的第5天和热板实验的第1-7天BDL组显著增强了吗啡的镇痛作用； （4）TUDCA缓解吗啡耐受的作用在TGR5基因敲除小鼠并不显著； （5）TUDCA灌胃处理对吗啡耐受小鼠肠道菌群分布没有显著影响； （6）DCA灌胃处理显著减少了野生型和TGR5基因敲除小鼠吗啡耐受结直肠粪便残留，TUDCA灌胃处理显著减少了野生型吗啡耐受小鼠结直肠粪便残留。 小结：外源性胆汁酸TUDCA和DCA干预可以一定程度上缓解小鼠吗啡耐受和便秘症状；胆管结扎手术升高内源性胆汁酸对小鼠吗啡耐受也具有改善作用。 第三部分DRG巨噬细胞在胆汁酸调控吗啡耐受中的作用及机制 目的： 明确吗啡耐受小鼠背根神经节中巨噬细胞浸润及胆汁酸受体表达情况，阐明TUDCA和DCA在LPS刺激下对巨噬细胞极化的体外效应，及胆汁酸受体TGR5和FXR在此过程中发挥的作用。探讨TUDCA和DCA诱导巨噬细胞释放内源性阿片肽的情况。 方法： （1）使用C57小鼠和CX3CR1GFP小鼠建立吗啡耐受模型，免疫荧光染色检测DRG上CD68、F4/80、Iba1、Cx3cr1阳性细胞的变化情况； （2）免疫荧光染色观察TGR5和FXR在DRG中的分布及与巨噬细胞的共标情况； （3）利用Raw264.7巨噬细胞系和小鼠骨髓源性巨噬细胞（BMDM），qPCR检测不同剂量TUDCA，DCA及TGR5特异性激动剂INT777或敲除TGR5以及FXR特异性激动剂INT747对LPS诱导的炎症因子的表达情况，明确对巨噬细胞极化的影响，qPCR检测TUDCA和DCA灌胃干预对吗啡耐受小鼠DRG中的炎症因子Il1b和Tnf表达的影响； （4）利用体外培养RAW264.7巨噬细胞系和骨髓源性巨噬细胞（BMDM），qPCR检测不同剂量TUDCA、DCA及TGR5特异性激动剂INT777及FXR特异性激动剂INT747诱导内源性阿片肽Penk、Pomc和Pdyn（阿片肽ENK、END和DYN的前体）的mRNA表达和释放的影响； （5）qPCR检测TUDCA和DCA灌胃干预对吗啡耐受小鼠DRG中Penk、Pomc和Pdyn的mRNA表达情况的影响。 结果： （1）免疫荧光结果显示CX3CR1GFP吗啡耐受小鼠DRG上巨噬细胞的数量增加，野生型吗啡耐受小鼠DRG上巨噬细胞分子标记物F4/80，CD68和Iba-1的表达增加，DRG存在胆汁酸受体TGR5和FXR； （2）qPCR结果显示胆汁酸TUDCA抑制Raw264.7巨噬细胞中Tnf，Il1b，Nos2的mRNA的表达水平，增加了Arg1的mRNA的表达水平； (3)TGR5和FXR激动剂抑制巨噬细胞Tnf和Il1b的mRNA的表达水平； (4)TUDCA抑制吗啡耐受小鼠DRG中Tnf和Il1b的mRNA的表达水平，增加了Arg1的mRNA的表达水平；免疫荧光结果显示吗啡耐受小鼠TUDCA干预后DRG上CD206巨噬细胞的数量增加； （5）qPCR和ELISA结果表明DCA（1μM）及FXR激动剂INT747（30μM）促进BMDMβ-内啡肽的合成和释放； （6）纳洛酮阻断了DCA（10mg/kg）对小鼠的急性镇痛作用； （7）qPCR结果显示DCA（50mg/kg）显著增加了吗啡耐受小鼠DRG中PomcmRNA的表达水平。 小结：胆汁酸TUDCA作用于TGR5缓解巨噬细胞炎症反应，胆汁酸DCA可能作用于FXR提高了巨噬细胞内源性阿片肽的释放。 结论：吗啡耐受引起小鼠体内胆汁酸代谢改变，并且补充胆汁酸可以缓解吗啡耐受的发展。体外实验表明TGR5参与胆汁酸促进巨噬细胞向抑炎表型极化，而FXR可能参与胆汁酸诱导内源性阿片类物质的合成和释放。这些发现提示胆汁酸代谢及其受体信号通路可能是吗啡耐受的潜在治疗靶点。
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