摘要
研究背景： 心血管疾病是世界上主要死亡原因之一，在各种心血管疾病的病理过程中，交感神经过度激活促进了心血管疾病的发生和发展，最终导致心力衰竭，而心血管疾病发生发展导致心力衰竭的共同病理过程是心肌重构，心肌重构的机制中神经内分泌紊乱导致过度释放的儿茶酚胺刺激β-肾上腺素能受体，最终出现心输出量减少，但其慢性过度激活导致儿茶酚胺的持续释放是心力衰竭发生和发展的主要因素，从而促进心肌细胞凋亡、炎症反应，最终引起心力衰竭，因此儿茶酚胺过度释放是引起心肌损伤，进而导致心力衰竭的重要原因。 异丙肾上腺素（isoproterenol，ISO）是一种人工合成的儿茶酚胺，具有β-肾上腺素能受体激动剂的活性，在动物模型中，ISO处理可模拟心脏交感神经过度激活的病理状态。研究表明，ISO促进心脏内大量氧自由基的产生，加重心肌缺血，也可诱发非缺血性心肌损伤，导致心功能不全。事实上，在ISO损伤期间，心肌细胞正在经历过度的细胞凋亡和坏死，随后吸引大量炎症细胞并促进炎症级联反应。心脏纤维化也是ISO诱导心肌损伤的重要特征，伴有大量细胞外基质沉积，导致心脏功能障碍。ISO诱导的心肌损伤包括心肌细胞凋亡、心肌炎症和心肌纤维化，这些变化导致心脏收缩和舒张功能障碍，最终导致心力衰竭。虽然使用β-肾上腺素能受体阻滞剂可以显著降低心力衰竭的发病率和死亡率，但是目前其发病率仍不断上升，死亡率与许多肿瘤相当约为50%，因此，β-肾上腺素能受体阻滞剂治疗心力衰竭尚不能达到理想效果，急需一种新的治疗儿茶酚胺过度释放诱导心肌损伤致心力衰竭的方法。 微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一种包含22个核苷酸的内源性非编码小RNA，广泛表达于多种细胞中，通过6到8个核苷酸序列组成的种子区域与靶基因的mRNA3''-非翻译区（3''UTR）结合来抑制翻译或诱导基因表达。miRNAs作为基因转录后调控因子已被证实在心力衰竭的致病机制中发挥作用，例如重塑、肥大、细胞凋亡和缺氧。近年来，miRNA-135a（miRNA-135a）的生物学功能受到了广泛关注，并发现它可在非小细胞肺癌、胶质瘤、子宫内膜癌、鼻咽癌及大肠癌等多种癌症中发挥重要作用。此外，既往研究发现miRNA-135a在心肌缺血再灌注大鼠模型及缺氧/复氧的H9c2细胞中可通过靶向蛋白络氨酸磷酸酯酶1B（PTP1B）抑制细胞凋亡。在糖尿病小鼠的心肌缺血再灌注损伤中，miRNA-135a的上调可通过靶向硫氧还蛋白-相互作用蛋白(TXNIP)发挥保护作用。miRNA-135a过表达可通过靶向巨噬细胞中的Toll样受体4（TLR4）来抑制泡沫细胞的形成、炎症和氧化应激从而减缓动脉粥样硬化的进展。然而，另有研究表明脓毒症患者血清中miRNA-135a上调，通过激活p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）/核因子κB（NF-κB）途径加重心肌炎症及心肌功能障碍。miRNA-135a在糖尿病小鼠的血管平滑肌细胞（VSMC）中表达增高且通过下调叉头框蛋白1（FOXO1）的表达来加重VSMC的炎症反应。既往研究还报道miRNA-135a在H2O2刺激下的大鼠心肌细胞中表达上调，通过下调B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）增加H9c2细胞的凋亡。miRNA-135a对心血管疾病的作用结果并不一致，在这项研究中从体外实验、体内实验两方面进行研究，首次探讨miRNA-135a在人工合成的儿茶酚胺ISO模拟交感神经过度活跃-循环儿茶酚胺水平升高诱导H9c2心肌细胞损伤和小鼠慢性心肌重构损伤中的作用和作用机制。 本研究分三部分进行： 第一部分体外实验：miRNA-135a在ISO诱导心肌细胞损伤中的表达变化及其对ISO诱导心肌细胞损伤的影响。 第二部分体外实验：miRNA-135a通过负向调控TLR4抑制ISO诱导的心肌细胞损伤。 第三部分体内实验：miRNA-135a对ISO诱导小鼠心肌损伤的影响及靶向抑制TLR4改善miR-135aantagomir诱导的小鼠心肌损伤。 第一部分体外实验：miRNA-135a在ISO诱导心肌细胞损伤中的表达变化及其对ISO诱导心肌细胞损伤的影响 研究目的 本研究体外培养H9c2心肌细胞，建立ISO诱导心肌细胞损伤模型，测定ISO预处理心肌细胞不同时间点miRNA-135a的表达；在H9c2心肌细胞中转染miRNA-135a或miRNA-135ainhibitor，检测miRNA-135a的表达情况；探讨过表达或抑制miRNA-135a表达对ISO诱导心肌细胞损伤的影响，测定心肌细胞活性、心肌细胞凋亡率、凋亡因子c-caspase3活性以及TNFα，IL-1，IL-6炎症因子水平。 研究方法 1、H9c2细胞培养：H9c2细胞来源于中科院上海细胞典藏中心，将细胞在含有15%胎牛血清的DMEM中培养，细胞密度至80%-90%时采用0.125%的胰酶进行消化传代，细胞培养于37℃培养箱中（5%CO2）。 2、H9c2损伤模型的建立：H9c2细胞ISO（10μM）处理24小时； 3、细胞实验分组 3.1实验一分组：明确miRNA-135a和miRNA-135ainhibitor在H9c2心肌细胞中转染效率，细胞分为2组：对照组；Ad-miRNA-135a组或miRNA-135ainhibitor组； 3.2实验二分组：在过表达实验中H9c2心肌细胞感染腺病毒载体过表达miRNA-135a（Ad-miRNA-135a），对照组H9c2心肌细胞感染腺病毒空载体（Ad-NC）；将细胞分为4组：Ad-NC-PBS；Ad-miRNA-135a-PBS；Ad-NC-ISO；Ad-miRNA-135a-ISO； 3.3实验三分组：在抑制实验中H9c2心肌细胞感染miRNA-135a抑制剂(miRNA-135ainhibitor)，对照组H9c2心肌细胞感染对照序列（anti-miRcon）。将细胞分为4组：CON-PBS；miRNA-135ainhibitor-PBS；CON-ISO；miRNA-135ainhibitor-ISO； 4、miRNA-135a的转录：用TRIzol试剂提取总RNA，microRNA135a逆转录使用microRNA135a逆转录试剂盒进行，最后使用LightCycler480SYBRGreenIMaste进行扩增，以GAPDH为参照； 5、miRNA-135a和miRNA-135ainhibitor的转染：分别使用腺病毒（Ad）、脂质体（lipo）2000将miRNA-135a和miRNA-135ainhibitor转染入H9c2心肌细胞，qRT-PCR检测miRNA-135a的表达情况； 6、CCK8试剂盒检测心肌细胞活性； 7、心肌细胞凋亡的检测：Tunel染色检测细胞凋亡率以及凋亡激活因子c-caspase3活性检测； 8、心肌细胞炎症因子水平的测定：Elisa试剂盒检测TNFα，IL-1，IL-6炎症因子水平。 研究结果： 1、qRT-PCR结果显示，ISO诱导心肌细胞损伤后miRNA-135a表达先升高后降低：在ISO刺激心肌细胞不同时间点（0h、6h、12h、24h、48h）miRNA-135a的表达在0–6小时后升高，然后在12–48小时后下降，结果表明miRNA-135a参与了心肌损伤的病理过程； 2、qRT-PCR结果显示，与Ad-NC组相比，Ad-miRNA-135a组miRNA-135a的表达水平明显升高（P＜0.01），上调约4.54倍，与CON组相比，miRNA-135ainhibitor组miRNA-135a的表达水平明显降低（P＜0.01），下调约72.6%； 3、CCK8试剂盒检测结果显示：与Ad-NC-ISO组相比，Ad-miRNA-135a-ISO组显著增加心肌细胞活力（增殖活力：81.75±4.59%比48.39±0.96%,P＜0.01）；与CON-ISO组相比，miRNA-135ainhibitor-ISO组显著减低心肌细胞活力（增殖活力：35.44±3.06%比43.46±1.71%,P＜0.01）； 4、Tunel染色检测结果显示：Ad-miRNA-135a-ISO组心肌细胞凋亡率显著低于Ad-NC-ISO组，Ad-miRNA-135a-ISO组细胞凋亡率为8.59±1.88%，Ad-NC-ISO组细胞凋亡率为18.71±2.99%，差异明显（P＜0.01）；miRNA-135ainhibitor-ISO组心肌细胞凋亡率显著高于CON-ISO组，miRNA-135ainhibitor-ISO组细胞凋亡率为22.07±2.53%，CON-ISO组细胞凋亡率为17.94±2.64%，差异明显（P＜0.01）。凋亡激活因子c-caspase3活性测定结果：Ad-miRNA-135a-ISO组心肌细胞中c-caspase3活性明显低于Ad-NC-ISO组（P＜0.01），下调约47%；miRNA-135ainhibitor-ISO组心肌细胞中c-caspase3活性明显高于CON-ISO组,（P＜0.01），上调约1.5倍； 5、心肌细胞炎症因子检测结果显示：Ad-miRNA-135a-ISO组心肌细胞TNFα，IL-1，IL-6含量明显低于Ad-NC-ISO组（P＜0.01）；miRNA-135ainhibitor-ISO组心肌细胞TNFα，IL-1，IL-6含量明显高于CON-ISO组（P＜0.01）； 结论： 1、体外建立ISO诱导的心肌细胞损伤模型中，miRNA-135a表达先升高后降低； 2、体外建立ISO诱导的心肌细胞损伤模型中，miRNA-135a过表达可通过降低心肌细胞凋亡率、凋亡激活因子c-caspase3活性以及TNFα，IL-1，IL-6炎症因子水平来减轻ISO诱导的心肌细胞损伤；相反，miRNA-135ainhibitor可通过增加心肌细胞凋亡率、凋亡激活因子c-caspase3活性以及TNFα，IL-1，IL-6炎症因子水平来加重ISO诱导的心肌细胞损伤。 第二部分体外实验：miRNA-135a负向调控TLR4抑制ISO诱导的心肌细胞损伤研究目的： miRNAs以靶基因的3ˊ-UTR为靶点进行调控，利用TargetScan数据库查询miRNA135a与TLR43ˊ-UTR结合位点的信息，构建TLR4靶序列的突变体进行双荧光素酶报告基因验证，在ISO诱导心肌细胞损伤模型中，过表达/抑制miRNA-135a表达，WesternBlot检测TLR4蛋白表达情况；体外建立ISO诱导心肌细胞损伤模型，miRNA-135ainhibitor和miRNA-135ainhibitor+TAK-242（TLR4受体抑制剂）分别转染H9c2心肌细胞，检测心肌细胞活性、凋亡率以及炎症因子水平（TNFα、IL-1、IL-6），体外实验验证TLR4受体抑制剂TAK-242减轻miRNA-135ainhibitor诱导的心肌细胞损伤，细胞水平证实miRNA-135a的靶基因是TLR4；H9c2心肌细胞感染Ad-miR135a或阴性对照，给予ISO刺激24小时，共完成6个样本的细胞RNA测序，通过GO功能富集分析和基因热图探讨miR-135a减轻ISO诱导心肌细胞损伤的可能作用机制。 研究方法： 1、生物信息学分析：利用Targetscan数据库查询miRNA135a与TLR43′-UTR结合位点的信息（https://www.targetscan.org/vert_80/）； 2、构建TLR4靶序列的突变体进行双荧光素酶报告基因验证，将含有TLR4野生型和突变型的质粒载体pLUC-TLR4-WT和pLUC-TLR4-Mut分别与miRNA-135ainhibitor以及阴性对照共同转染心肌细胞，验证miRNA-135a与靶基因TLR4的3＇UTR存在互补结合关系； 3、在ISO诱导心肌细胞损伤模型中，过表达/抑制miRNA-135a表达，WesternBlot检测TLR4蛋白表达情况； 4、在ISO诱导心肌细胞损伤模型中，通过miRNA-135ainhibitor和miRNA-135ainhibitor+TAK-242（TLR4受体抑制剂）转染H9c2心肌细胞，检测心肌细胞活性、凋亡率以及炎症因子TNFα、IL-1、IL-6； 5、H9c2心肌细胞感染Ad-miR135a或阴性对照，给予ISO刺激24小时，由武汉学士园生物科技有限公司完成细胞RNA测序和生物信息分析； 6、细胞实验分组： 6.1实验一分组：构建TLR4靶序列的突变体进行双荧光素酶报告基因验证， 野生型荧光素酶报告载体（TLR4-WT）+miRNA-135ainhibitor；野生型荧光素酶报告载体（TLR4-WT）+CON；突变型荧光素酶报告载体（TLR4－Mut）＋miRNA-135ainhibitor；突变型荧光素酶报告载体（TLR4－Mut）+CON； 6.2实验二分组：WesternBlot检测TLR4蛋白表达 Ad-NC-ISO；Ad-miRNA-135a-ISO；CON-ISO；miRNA-135ainhibitor-ISO； 6.3实验三分组：体外实验验证miRNA-135a的靶基因是TLR4，分为 miRNA-135ainhibitor；miRNA-135ainhibitor+TAK-242； 6.4实验四分组:共完成6个样本的心肌细胞RNA测序，分为Ad-NC-ISO；Ad-miR135a-ISO。 研究结果： 1.Targetscan数据库预测TLR4是miRNA-135a的靶基因； 2.双荧光素酶报告实验显示：与对照组比较，转染了野生型TLR4-3＇-UTR和miRNA-135ainhibitor组的荧光素酶活性显著升高（P=0.028），而转染突变型TLR4-3′-UTR和miRNA-135ainhibitor组与对照组相比荧光素酶活性无显著性差异（P＞0.866）。结果表明miRNA-135a可直接与TLR4-3′-UTR作用； 3.免疫印迹结果显示：miRNA-135ainhibitor-ISO组细胞TLR4的蛋白表达高于CON-ISO组（TLR4相对表达量：0.32±0.01比0.14±0.01，P＜0.01），而Ad-miRNA-135a-ISO组细胞TLR4的蛋白表达低于Ad-NC-ISO组（TLR4相对表达量0.05±0.01比0.16±0.01，P＜0.01），结果表明miRNA-135a负向调控TLR4蛋白表达； 4.细胞水平验证miRNA-135a的靶基因是TLR4：与ISO+miRNA-135ainhibitor组相比，ISO+miRNA-135ainhibitor+TAK-242组心肌细胞活性明显增高（增殖活力：187.14±18.27%比100±16.41%，P＜0.01），细胞凋亡率明显减低（12.40±2.20%比23.63±2.66%，P＜0.01），凋亡因子c-caspase3活性、炎症因子TNFα，IL-1，IL-6水平明显减低（P＜0.01）； 5.细胞RNA测序技术发现miR-135a降低心肌细胞TLR4信号通路炎症相关基因TLR4、NF-κB、RelB、CCRL2、IL-1β和细胞凋亡相关基因Bax、Bak1、Bik、BNIP1的表达，增加抗凋亡基因Bcl-2的表达。 结论： 1.H9c2心肌细胞中TLR4是miRNA-135a的靶基因，miRNA-135a通过与TLR4的3′-UTR相互作用，抑制其蛋白的表达，负向调节TLR4转录活性。 2.TAK-242靶向抑制TLR4减少miRNA-135ainhibitor诱导的H9c2心肌细胞凋亡、凋亡因子c-caspase3活性以及TNFα，IL-1，IL-6炎症因子水平，细胞水平验证了miRNA-135a的靶基因是TLR4。 3.miRNA-135a减轻ISO诱导的H9c2心肌细胞损伤，其机制可能与心肌细胞TLR4信号通路炎症相关基因TLR4、NF-κB、RelB、CCRL2、IL-1β和细胞凋亡相关基因Bax、Bak1、Bik、BNIP1的低表达，抗凋亡相关基因Bcl-2的高表达有关。 第三部分体内实验：miRNA-135a对ISO诱导小鼠心肌损伤的影响及靶向抑制TLR4改善miR-135aantagomir诱导的小鼠心肌损伤 研究目的 本研究首先通过小鼠眶后静脉丛注射携带miRNA-135a的腺病毒，qRT-PCR检测miRNA-135a在小鼠心肌组织中转染情况，然后制作ISO诱导的C57BL/6J小鼠心肌损伤模型，qRT-PCR检测小鼠心肌组织不同时间点miRNA-135a的表达。小鼠皮下植入胶囊渗透压泵持续泵入ISO，通过小鼠眶后静脉丛注射携带miRNA-135a的腺病毒，探讨过表达miRNA-135a对ISO诱导小鼠心肌损伤的影响及其可能的作用机制。最后设置对照组、ISO组、miRNA-135aantagomir/ISO组；miRNA-135aantagomir/ISO+TAK-242组，探讨miRNA-135aantagomir是否恶化ISO诱导的小鼠心肌损伤和靶向抑制TLR4是否可以改善miRNA-135aantagomir诱导的小鼠心肌损伤，体内实验验证miRNA-135a的靶基因是TLR4。 研究方法 ISO诱导C57BL/6J小鼠心肌损伤模型的建立及分组：小鼠肩胛骨间皮下植入胶囊微型泵（ISO每天60mg/kg，持续泵入14天）建立小鼠心肌损伤模型； 1.实验一：qRT-PCR测定ISO诱导小鼠心肌损伤模型中心肌组织miRNA-135a的表达； 2.实验二：通过小鼠眶后静脉丛注射携带miRNA-135a的腺病毒，qRT-PCR测定miRNA-135a在小鼠心肌组织中转染情况。实验分为以下2组：Ad-NC；Ad-miRNA-135a；每组6只小鼠； 3.实验三：小鼠体内注射ISO前2周进行眶后静脉丛注射Ad-miRNA-135a，小鼠皮下持续泵入ISO2周后，探讨miRNA-135a对ISO诱导小鼠心肌损伤的影响。实验分为以下4组：Ad-NC/NS组;Ad-miRNA-135a/NS组;Ad-NC/ISO组;Ad-miRNA-135a/ISO组；每组15只小鼠； 3.1小动物超声检测小鼠心功能：LVIDd、LVEF、LVFS、E/A和心导管检查评价小鼠心脏血流动力学：EDP、dp/dtmax、dp/dtmin； 3.2采用LDH试剂盒和TNI试剂盒检测心肌组织中LDH和TNI的含量； 3.3采用TUNEL染色和c-caspase3活性试剂盒检测心肌组织中细胞凋亡率和c-caspase3活性； 3.4采用天狼星红（PSR）染色评价各组心肌组织胶原含量； 3.5采用实时荧光PCR（qRT-PCR）检测各组心肌组织中纤维化分子标志物的转录水平包括：Ⅰ型胶原蛋白（collagenⅠ），Ⅲ型胶原蛋白（collagenⅢ），α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和转化生长因子β（TGFβ）； 3.6采用HE染色检测心肌组织形态学改变； 3.7采用CD45和CD68免疫组织化学染色检测各组心肌组织中CD45和CD68标记的白细胞以及巨噬细胞数量； 3.8Elisa试剂盒检测各组小鼠心肌组织中肿瘤坏死因子α（TNFα）、白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）的水平； 3.9Westernblot检测TLR4信号通路炎症、凋亡相关基因和抗凋亡基因的蛋白表达水平。 4.实验四:miRNA-135aantagomir是否恶化ISO诱导的小鼠心肌损伤以及体内实验确认TLR4是否为miRNA-135a的靶基因。实验分为以下4组：对照组（CON）；ISO组；miRNA-135aantagomir/ISO组；miRNA-135aantagomir/ISO+TAK-242组；每组15只小鼠； 4.1小动物超声检测小鼠心功能：LVIDd、LVEF、LVFS、E/A； 4.2采用c-caspase3活性试剂盒检测心肌组织中c-caspase3活性； 4.3采用LDH试剂盒和TNI试剂盒检测心肌组织中LDH和TNI的含量； 4.4采用天狼星红（PSR）染色评价各组小鼠心肌组织胶原含量； 4.5采用酶联免疫吸附试验（Elisa）检测各组小鼠心肌组织中炎症标志物的水平，包括肿瘤坏死因子α（TNFα），白细胞介素-1（IL-1），白细胞介素-6（IL-6）； 4.6采用HE染色检测心肌组织形态学改变； 研究结果： 1、qRT-PCR结果显示在ISO持续泵入的第2,4,6,8,10,14天，小鼠心肌组织中miRNA-135a表达先升高后降低，在第6天时达到顶峰，在第8,10,14天呈递减趋势，与体外实验结果一致，体内实验也证明了miRNA-135a参与了心肌损伤的病理过程； 2、通过小鼠眶后静脉丛给予Ad-NC或Ad-miRNA-135a注射处理后，与Ad-NC组小鼠相比，Ad-miRNA-135a组小鼠心肌组织中miRNA-135a的表达在注射后的第2,3,4周明显高于Ad-NC组，且有表达升高的趋势，差异明显（P＜0.05）； 3、小动物心脏超声和心导管检查结果：心脏超声结果表明Ad-miRNA-135a/ISO组小鼠的左室射血分数（LVEF）高于Ad-NC/ISO组小鼠（72.10±3.45%比52.89±7.38%，P＜0.05），短轴缩短率（LVFS）显著高于Ad-NC/ISO组小鼠（22.62±3.45%比11.27±1.55%,P＜0.01），左室舒张末期内径（LVIDd）低于Ad-NC/ISO组小鼠（3.41±0.08mm比3.64±0.10mm，P＜0.05）；心导管检查结果表明：Ad-miRNA-135a/ISO组小鼠dp/dtmin高于Ad-NC/ISO组小鼠（-8631±-779mmHg/s比-7131±-779mmHg/s，P＜0.05），dp/dtmax和E/A比值显著高于Ad-NC/ISO组小鼠（dp/dtmax：8832±713mmHg/s比7242±608mmHg/s；E/A比值：1.88±0.12比1.58±0.15，P＜0.01），左室舒张末期内压力（EDP）显著低于Ad-NC/ISO组小鼠（9±2.32mmHg比15.4±1.42mmHg，P＜0.01）； 4、过表达Ad-miRNA-135a对ISO诱导心肌组织损伤的影响：与Ad-NC/ISO组小鼠相比，Ad-miRNA-135a/ISO组小鼠显著降低LDH、TNI水平、心肌组织细胞凋亡率以及c-caspase3活性（P＜0.01），显著降低小鼠心肌组织中胶原含量以及collagenⅠ、collagenⅢ，α-SMA和TGFβ的mRNA水平（P＜0.01），显著降低心肌组织中CD45和CD68标记的阳性细胞数量以及炎症因子TNFα，IL-1，IL-6的水平（P＜0.01），减少心肌组织HE染色的炎症细胞浸润（P＜0.01）。 5、Westernblot检测心肌组织中TLR4信号通路相关基因的蛋白表达：Ad-miR-135a/ISO组小鼠心肌组织中炎症相关基因TLR4、P-AKT、P-P65、NLRP3以及凋亡相关基因BAX、c-caspase3的蛋白水平显著低于Ad-NC/ISO组小鼠，抗凋亡基因BCL2的蛋白表达显著高于Ad-NC/ISO组小鼠（P＜0.01）。 6、miRNA-135aantagomir恶化ISO诱导的小鼠心肌损伤。与ISO组小鼠比较，miRNA-135aantagomir/ISO组小鼠降低了左室射血分数（LVEF）、短轴缩短率（LVFS）（LVEF：45.29±8.40%比56.75±6.90%；LVFS：15.48±1.94%比21.24±1.44%，P＜0.05），增加了左室舒张末期内径（LVIDd）（3.90±0.16mm比3.69±0.14mm，P＜0.05），增加了小鼠心脏组织中胶原含量、c-caspase3活性、炎症因子TNFα，IL-1，IL-6的水平（P＜0.05），加重心肌组织HE染色的炎症细胞浸润（P＜0.05）。 7、体内实验确认miRNA-135a的靶基因是TLR4。与miRNA-135aantagomir/ISO组小鼠相比，miRNA-135aantagomir/ISO+TAK-242组小鼠显著增加了左室射血分数（LVEF）、短轴缩短率（LVFS）（LVEF：57.03±7.03%比45.29±8.40%；LVFS：21.91±2.24%比15.48±1.94%，P＜0.01），显著减少了左室舒张末期内径（LVIDd）（3.58±0.11mm比3.90±0.16mm，P＜0.01），显著降低了小鼠心肌组织中胶原含量、c-caspase3活性、炎症因子TNFα，IL-1，IL-6的水平（P＜0.01），减少心肌组织HE染色的炎症细胞浸润（P＜0.01）。 结论 1、ISO诱导的小鼠心肌损伤模型中，miRNA-135a表达先升高后降低，与体外实验结果一致； 2、miRNA-135a通过显著降低TLR4信号通路炎症相关基因TLR4、P-P65、NLRP3、P-AKT以及凋亡相关基因BAX、c-caspase3的蛋白表达水平，显著提高抗凋亡基因BCL2的蛋白表达水平来减轻ISO诱导的炎症反应、心肌细胞凋亡，从而抑制心肌纤维化，最终改善小鼠慢性心肌重构损伤导致的心脏功能衰竭。 3、miRNA-135aantagomir促进ISO诱导小鼠心肌损伤模型中的炎症反应、心肌细胞凋亡，从而加重心肌纤维化和心功能紊乱，TAK-242靶向抑制TLR4减轻miRNA-135aantagomir诱导的小鼠炎症反应和心肌细胞凋亡，从而改善心肌纤维化和心功能紊乱，在体内实验中再次验证了miRNA-135a靶基因是TLR4。
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