摘要
背景 葡萄膜黑色素瘤是一种恶性肿瘤，起源于眼睛中的色素细胞，它可以迅速生长并转移至其他部位，对患者生命造成严重威胁，目前对葡萄膜黑色素瘤仍缺乏有效的治疗手段。白藜芦醇是一种天然存在于许多植物中的多酚化合物，被认为具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤活性。研究表明，白藜芦醇可能对多种疾病具有治疗潜力，包括心血管疾病、糖尿病、癌症等。miR-512-3p是一种微小RNA分子，是调控基因表达的重要调节因子之一，研究表明miR-512-3p在肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病等多种疾病中的均有异常表达。 目的 探究白藜芦醇抑制葡萄膜黑色素瘤细胞自噬并促进其凋亡的调控作用及机制，为葡萄膜黑色素瘤的治疗提供新的靶点和策略。 方法 将葡萄膜黑色素瘤细胞（MUM2B）分为对照组、实验组,分别用不同浓度的白藜芦醇(0、10、20、40、60、80μmol/L)处理细胞。划痕实验检测细胞迁移率，CCK-8检测细胞活力，DCFH-DA探针检测细胞活性氧，流式细胞术检测细胞凋亡，通过qRT-PCR和Westernblot检测miR-512-3p、DUSP1及其他目的蛋白的表达。RIP实验验证miR-512-3p靶向沉默DUSP1。使用miR-512-3p的mimic以及DUSP1的过表达质粒，在体外实验评估miR-512-3p、DUSP1的生物学意义。 结果 1.白藜芦醇抑制葡萄膜黑色素瘤的增值与侵袭:为研究白藜芦醇在抑制葡萄膜黑色素瘤细胞增殖与侵袭中作用，我们使用不同浓度白藜芦醇(0、10、20、40、60、80μmol/L)处理MUM2B细胞，结果表明高浓度白藜芦醇（60μm，80μm）可以明显抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖与侵袭。 2.白藜芦醇通过抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的自噬促进其凋亡:使用不同浓度白藜芦醇处理细胞，Westernblot结果显示，P62大量蓄积，LC3B表达减少，Bax和Caspase3剪切体蛋白表达增多，Bcl2蛋白表达减少。使用雷帕霉素处理经白藜芦醇治疗后的葡萄膜黑色素瘤细胞，结果显示雷帕霉素激活了细胞自噬，抑制了白藜芦醇导致的细胞凋亡。 3.白藜芦醇减轻葡萄膜黑色素瘤细胞的氧化应激:为探究白藜芦醇是否影响葡萄膜黑色素瘤细胞的氧化应激水平，使用不同浓度白藜芦醇处理细胞，Westernblot与qRT-PCR结果显示，白藜芦醇降低了葡萄膜黑色素瘤细胞氧化相关蛋白的表达。DCFH-DA结果显示白藜芦醇减少了葡萄膜黑色素瘤细胞的活性氧产生。JC-1结果显示白藜芦醇降低了葡萄膜黑色素瘤细胞的膜电位水平。 4.白藜芦醇通过促进miR-512-3p的表达靶向抑制DUSP1:通过qRT-PCR检测，发现miR-512-3p在白藜芦醇治疗的葡萄膜黑色素瘤细胞中高表达。生息分析与数据库预测到，miR-512-3p在葡萄膜黑色素瘤细胞中低表达并且与DUSP1存在靶向结合位点。RIP实验显示，miR-512-3P能够与AGO2形成沉默复合体靶向抑制DUSP1。此外过表达miR-512-3p抑制了DUSP1的表达。 5.miR-512-3p抑制了葡萄膜黑色素瘤细胞的增值促进细胞凋亡:过表达miR-512-3p抑制了葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖。此外，通过qRT-PCR检测Bax、Bcl2的表达，通过Hochest33342与Tunel检测细胞凋亡，结果表明，过表达miR-512-3p促进了葡萄膜黑色素瘤细胞的凋亡抑制了细胞增殖。 6.白藜芦醇通过抑制DUSP1的表达参与调控葡萄膜黑色素瘤的进展:通过生信分析我们发现DUSP1在葡萄膜黑色素瘤细胞中高表达，并且与ERK通路表现出密切相关。Westernblot结果表明，随着白藜芦醇浓度的升高，在60μM时DUSP1的表达出现明显下降。免疫荧光结果也表明白藜芦醇抑制了DUSP1的表达。 7.DUSP1通过抑制ERK通路激活促进葡萄膜黑色素瘤细胞的增值与侵袭:研究中发现，白藜芦醇促进了ERK蛋白的表达，并随白藜芦醇浓度的增加而越发显著。Westernblot结果显示过表达DUSP1抑制了ERK蛋白的激活。并且过表达DUSP1能够逆转白藜芦醇治疗导致的细胞凋亡。 结论 我们的研究为白藜芦醇治疗葡萄膜黑色素瘤提供了一种可能。研究结果表明，白藜芦醇通过促进miR-512-3p的表达靶向抑制DUSP1，从而促进ERK通路的激活，抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的自噬并促进其凋亡，为寻找葡萄膜黑色素瘤新的治疗靶点提供了理论依据。
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