摘要
目的： 通过公共数据库进行生物信息学分析，探究在人类衰竭心脏组织中内质网应激与纤维化相关基因的关系。在动物水平研究衰老SD大鼠、C57BL/6小鼠心脏的病理学改变，检测内质网应激及纤维化相关分子的表达。在细胞水平研究ATF6通过TXNDC5及NOX4介导衰老心肌细胞纤维化及4-PBA的保护机制。 方法： 1、生物信息学分析 应用R语言对公共数据库GeneExpressionOmnibus（GEO）衰竭人类心脏组织转录组测序进行分析，观察衰竭心脏中内质网应激及纤维化相关基因的表达差异；差异基因富集分析；内质网应激与纤维化两者间的相关性分析。 2、自然衰老动物模型 (1)自然衰老SD雄性大鼠记录心脏重量及体重；检测血清中肌酸激酶亚型（CKMB)水平的变化。 (2)HE染色观察心脏和胸腺组织的病理学变化，Masson染色和天狼星红染色（SiriusRedStaining）观察心脏组织的胶原沉积现象；衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色试剂盒检测心脏衰老状态；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、免疫组化实验（IHC）和Westernblot（WB）实验检测胸主动脉组织ATF6、TXNDC5、CHOP、NOX4、α-SMA、COL1A1、p16、p21、p53等mRNA和蛋白质水平的变化。 3、细胞实验 (1)对H9c2细胞通过不同浓度梯度的D-半乳糖（D-Galactose，D-gal,0、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L）作用48h诱导细胞衰老，通过CCK-8、SA-β-gal检测细胞增殖活性和细胞衰老情况；流式细胞术检测细胞内总ROS变化；取细胞上清液检测乳酸脱氢酶（LDH）释放量；qRT-PCR、WB和细胞免疫荧光实验（IF）检测内质网应激和纤维化相关基因的mRNA和蛋白质水平变化。 (2)使用4-苯基丁酸（4-phenylbutyricacid，4-PBA）治疗D-gal诱导的H9c2衰老模型。通过CCK8检测增殖活性；SA-β-Gal染色检测细胞衰老情况；通过JC-1检测线粒体膜电位变化；线粒体超氧化物指示剂（MitoSOX）检测线粒体ROS变化。流式细胞术检测细胞周期变化、细胞内总ROS变化；qRT-PCR、WB、IF检测ATF6、TXNDC5、CHOP、NOX4、α-SMA、COL1A1等分子的表达变化。 (3)使用ATF6抑制剂Ceapin-A7以及siRNA对ATF6进行敲低构建ATF6低表达模型。通过CCK8检测增殖活性；SA-β-Gal染色检测细胞衰老情况；实时荧光定量PCR、WB检测ATF6、TXNDC5、CHOP、NOX4、α-SMA、COL1A1等分子的表达变化。 4、药物诱导衰老动物模型并治疗 (1)模型组为C57BL/6小鼠腹腔注射D-gal200mg/kg/day持续12周；治疗组在注射D-gal8周后注射4-PBA500mg/kg/day持续4周；对照组腹腔注射生理盐水直至试验结束。记录体重及饮食饮水变化。 (2)活体动物实验检测小鼠心电图及超声心动图变化。 (3)检测血清中CKMB、LDH、NT-proBNP等心功能相关指标变化；灌注固定取小鼠心脏组织及胸腺组织。HE染色观察心脏和胸腺组织的病理学变化，Masson染色和天狼星红染色观察心脏组织的胶原沉积现象；透射电镜（TEM）观察心肌细胞内线粒体及内质网变化；SA-β-gal试剂盒检测心脏衰老状态；qRT-PCR、IHC和WB实验检测胸主动脉组织ATF6、TXNDC5、CHOP、NOX4、α-SMA、COL1A1、p53等mRNA和蛋白质水平的变化。 结果： 1、生物信息学分析 在人类衰竭心脏组织转录组测序结果中分析可得知，与正常组差异基因可富集到与内质网应激及纤维化相关通路；内质网应激与纤维化相关基因表达上调；内质网应激基因与纤维化相关基因有强相关性，其中TXNDC5尤为突出。 2、自然衰老动物模型 对比Young组，Old组SD大鼠体重和血清中CKMB含量增加。HE结果显示，Young组大鼠心脏组织排列有序、细胞规则，Old组大鼠心肌组织细胞增厚、排列紊乱细胞大小不均一；Young组胸腺组织皮质与髓质界限清晰、分布规则，Old组胸腺组织皮质与髓质界限不清，髓质减少，胸腺不规则萎缩。纤维化染色及衰老染色结果显示，对比Young组，Old组大鼠心脏组织胶原纤维增多，衰老着色明显。IHC、qRT-PCR、WB结果显示，对比Young组，Old组大鼠心脏组织内ATF6、TXNDC5、CHOP、NOX4、α-SMA、COL1A1、p16、p21、p53表达水平上升。 3、细胞实验 (1)通过CCK-8细胞活性实验、SA-β-gal衰老染色、免疫荧光实验、细胞内ROS检测以及LDH含量确定D-gal50g/L作用48h是诱导H9c2细胞衰老的最佳条件，0.5mM4-PBA预处理2h能够对细胞衰老程度有所改善。诱导衰老细胞内质网应激以及纤维化相关指标表达升高，4-PBA治疗组相关指标相比于诱导衰老组下降。 (2)通过细胞周期、JC-1、MitoSOX实验，可知D-gal诱导衰老组细胞周期发生阻滞，线粒体膜电位升高，线粒体内ROS水平升高；4-PBA治疗组相比于衰老组细胞周期、线粒体膜电位、线粒体内ROS水平有所改善。 (3)通过IF共定位实验可知，在诱导衰老及改善过程中，ATF6与TXNDC5及NOX4有相同的位置变化及趋势改变，可以猜测衰老致心肌细胞纤维化与ATF6-TXNDC5-NOX4轴有强烈的关联作用。 4、药物诱导衰老模型并治疗 通过小鼠活体实验测量心电图及超声心动图、取血清测量心功能相关指标CKMB、LDH可知D-gal能够促进心脏功能衰竭，4-PBA对其有减缓作用。HE、MASSON、天狼星红染色结果可见诱导衰老组心脏组织出现明显纤维化，4-PBA能够减缓纤维化；诱导衰老组胸腺组织髓质减少、发生不规则萎缩，治疗组胸腺有所恢复。取心脏组织进行透射电镜可见衰老组内线粒体排列为乱，大小不均一，脂滴增多。IHC、qRT-PCR、WB实验结果显示ATF6、TXNDC5、CHOP、NOX4、α-SMA、COL1A1、p16、p21、p53表达水平上升；4-PBA治疗组相关指标表达水平有所恢复。 结论： 1、人类衰竭心脏中内质网应激与纤维化相关基因表达上调且存在关联性。 2、自然衰老的SD大鼠心脏中病理结构发生变化，心脏功能下降，伴随内质网应激及纤维化相关基因的表达变化。 3、D-gal构建H9c2细胞衰老模型中细胞周期阻滞，细胞内及线粒体内ROS积累，线粒体膜电位改变，内质网应激及纤维化相关基因表达上调，4-PBA对其有缓解作用。具体机制可能与抑制ATF6-TXNDC5-NOX4轴有关。 4、在ATF6抑制剂及敲低细胞模型中，确认了ATF6与细胞衰老相关，且ATF6可能通过TXNDC5及NOX4促进心肌细胞纤维化的发生。 5、D-gal能够诱导小鼠衰老及心脏功能衰竭呈现出纤维化的表型，4-PBA对其有恢复作用。
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