摘要
目的：糖尿病（Diabetesmellitus，DM）近年来在中国国内患病率逐年上升，不仅对我国人口健康产生了严重影响，而且带来了巨大的经济负担。相比于非糖尿病人群，DM患者心血管疾病的患病率更高，其中包括心力衰竭，心绞痛、非致死性心肌梗死以及心脏骤停。随着科学技术的不断进步，临床已经开发不少药物用于心血管疾病治疗，但治疗后的缺血再灌注（Ischemia/Reperfusion，I/R）损伤仍是患者预后的重大健康挑战。目前多项大型临床实验研究发现钠-葡萄糖协同转运蛋白2（Sodium-glucosecotransporters2，SGLT-2）抑制剂能够在治疗糖尿病的同时还能对心血管疾病起到一定保护作用。然而，关于SGLT-2抑制剂的心脏保护作用及其对心肌缺血损伤的潜在线粒体保护机制的研究缺乏。其中，琥珀酸脱氢酶（SuccinateDehydrogenase，SDH）作为线粒体连接氧化磷酸化与电子传递的枢纽之一，在调节线粒体功能中发挥重要作用。我们的研究旨在评估卡格列净（Canagliflozin，CANA）是否可以通过调节线粒体酶SDH活性来减轻心肌H/R（Hypoxia/Reoxygenation，H/R）损伤以及改善线粒体功能。 方法：本研究旨在通过体外模型系统评估CANA治疗对再灌注损伤后线粒体SDH和功能的影响。实验将H9c2细胞传代培养后随机分为6组：NG+CON组（正常糖+空白对照组）、NG+H/R组（正常糖+缺氧复氧组）和NG+H/R+CANA组（正常糖+缺氧复氧+卡格列净组）、HG+CON组（高糖+空白对照组）、HG+H/R组（高糖+缺氧复氧组）和HG+H/R+CANA组（高糖+缺氧复氧+卡格列净组）。高糖组细胞采用高糖DMEM培养；H/R组则是将细胞置于缺氧小室中进行缺氧12h和复氧4h处理；CANA组则在H/R前12h加入CANA进行预处理，后续处理同H/R组。各组细胞造模结束后，采用CCK-8法检测一定浓度CANA预处理后细胞活力、流式细胞术检测细胞凋亡率、倒置显微镜下观察线粒体膜电位变化以及细胞内活性氧ROS水平、化学法及ELISA法分别检测线粒体SDH酶活性和能量代谢产物ATP含量、Westernblot分子生物学方法测定心肌细胞内线粒体生物发生蛋白PGC-1α和Nrf2表达水平变化。 结果：1.采用CCK-8来检查细胞活力。实验结果显示，无论是正常糖还是高糖浓度处理的细胞，H/R组与CON组相比，心肌细胞活力下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与H/R组相比，随着CANA浓度不断上升，细胞活力下降并不显著（P＞0.05）。 2.采用Annexin-V-FITC/PI双染法来检测细胞凋亡。实验结果显示，与H/R组相比，CANA（10μmol/L）组心肌细胞活力不具有明显差异。CANA对正常糖CON组、H/R组、H/R+CANA组细胞凋亡率分别为14.08%、19.6%、16.84%。高糖组细胞凋亡率分别为15.94%、24.69%和16.96%。相较于H/R，CANA预处理的H9c2细胞凋亡率明显降低（P＜0.05）。 3.采用JC-1荧光探针来检查线粒体膜电位变化。结果表明，无论是正常糖还是高糖浓度处理的细胞，与CON组相比，H/R组平均荧光强度比值明显增强（P＜0.05）。与H/R组相比，两组H/R+CANA组的荧光强度比值均明显下降（P＜0.05）。一定浓度的CANA可以减轻由于H/R损伤导致的线粒体膜电位降低。4.通过WestenBlot检测线粒体发生蛋白PGC-1α及Nrf2表达状况。结果表明，与CON组相比，无论是正常糖还是高糖浓度处理的H9c2细胞，PGC-1α和Nrf2蛋白表达水平均降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。H/R+CANA组与H/R组相比，PGC-1α和Nrf2蛋白表达水平均增高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。5.通过ELISA法检测来检测SDH活性及ATP生成量。研究发现，作为三羧酸循环中的重要酶体，无论是正常糖还是高糖浓度处理的细胞，与CON组相比，H/R组心肌细胞的SDH活性增强，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。CANA预处理组与H/R组相比，SDH活性相较下降（P＜0.05），同时表现出一定的浓度相关。与CON组相比，H/R组细胞ATP生成量有所增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。H/R+CANA组与H/R组相比，ATP生成量则有所增加（P＜0.05）。6.通过ROS荧光探针检测H/R处理后细胞内ROS生成量。结果表明，无论是正常糖还是高糖浓度处理的细胞，与CON组相比，H/R组细胞ROS平均荧光强度更高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。H/R+CANA组与H/R组相比，荧光强度则相对降低（P＜0.05）。 结论： 1.CANA可以通过减少H9c2心肌细胞凋亡来减轻心肌损伤。 2.无论是在高糖或正常糖环境中，CANA均可通过提高线粒体膜电位，增强线粒体生物发生蛋白表达改善H/R期间H9c2心肌细胞线粒体功能。 3.CANA可以通过抑制H/R期间线粒体SDH活性来减少ROS产生，增加ATP生成量，调节细胞能量代谢，进而对H9c2细胞发挥保护作用。
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