摘要
目的：表观遗传调控失衡被认为是导致帕金森病（Parkinson’sdisease，PD）发生的重要因素之一。在PD的疾病进程中，突触功能受损是导致神经元死亡的关键因素之一。尽管如此，关于PD中表观遗传调控对于突触功能影响的研究鲜有报道。因此我们构建了α-突触核蛋白预制纤维（α-synucleinpreformedfibrils,PFFs）的细胞体外模型以及利用PFFs构建的模型小鼠，旨在探究PD中的表观遗传调控紊乱对于突触的影响，以及是否能够通过相关的干预措施来挽救PD中的突触受损和运动功能的障碍。 方法：首先，对制备的PFFs进行结构和性质鉴定。之后在体外培养的原代神经元中进行外源添加PFFs的处理，通过实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-TimeQuantitativePolymeraseChainReaction，RT-qPCR）、蛋白质免疫印迹法（WesternBlot）以及细胞免疫荧光染色检测原代神经元中组蛋白甲基化的改变；随后对原代神经元中的突触相关基因的转录水平和蛋白水平的变化进行检测；并通过构建的HEK293-α-syn-GFP的稳转细胞系探究α-syn与组蛋白甲基化之间的关系。在体外的药物干预实验中，首先在HEK293-α-syn-GFP稳转细胞系中对常染色质组蛋白赖氨酸甲基转移酶1（Euchromatichistone-lysineN-methyltransferase1，EHMT1）和常染色质组蛋白赖氨酸甲基转移酶2（Euchromatichistone-lysineN-methyltransferase2，EHMT2）的靶点抑制剂A-366进行特异性验证。随后，使用该药物处理体外培养的原代神经元，通过qPCR对突触相关蛋白基因转录水平的改变进行检测；通过WesternBlot检测A-366和短发夹RNA（shorthairpinRNA，shRNA）对突触相关基因以及表观调控因子蛋白水平的改变；随后通过染色质免疫共沉淀实验（ChromatinImmunoprecipitation，ChIP）确定原代神经元中表观调控的相关突触基因及其作用的基因区域。通过乳酸脱氢酶（Lactatedehydrogenase，LDH）释放实验和PI染色检测药物A-366对原代神经元死亡的影响；细胞计数试剂（CellCountingKit-8，CCK-8）检测药物干预对原代神经元存活情况的影响。为了更加直观地观测原代神经元中表观调控对突触的影响，运用了细胞免疫荧光染色和透射电镜（TransmissionElectronMicroscope，TEM）技术，观测原代神经元的形态、突触结构和突触数目的改变。采用脑立体定位注射PFFs的方式，构建PD小鼠在体模型，并在立体定位注射一个月的时间点，通过免疫组织化学法（Immunohistochemistry，IHC）对PFFs的小鼠模型进行初步验证。药物A-366的干预治疗开始于PFFs注射后的一个月，采用腹腔注射，每隔三天给药一次的方式，持续到PFFs注射后六个月。通过悬挂试验、转棒试验、爬杆试验和旷场试验等行为学试验检测小鼠的运动能力。运用免疫组化技术，检测小鼠多巴胺能（Dopaminergic，DA）神经元数目的病理性改变和小鼠体内表观调控的改变；运用WesternBlot和qPCR检测突触相关蛋白和表观调控在体水平的改变；通过高尔基体染色实验（Golgistaining）和免疫组化检测小鼠神经元树突棘和突触数目的改变。 结果：我们通过TEM证实了PFFs的纤维结构，并且通过WesternBlot和免疫荧光染色证实了PFFs在细胞内具有种子效应。在原代皮层神经元中，PFF处理导致常染色质组蛋白赖氨酸甲基转移酶EHMT1和EHMT2转录水平和蛋白水平的显著升高，以及由其介导的组蛋白H3上9位赖氨酸二甲基化（H3K9me2）水平的上调。该表观遗传调控的改变伴随着突触相关蛋白的下调，包括突触后致密蛋白95（Postsynapticdensityprotein95，PSD95）、突触素1（Synapsin1）、囊泡谷氨酸转运体1（Vesicularglutamatetransporter1，vGLUT1）和突触体相关蛋白25（Synaptosomal-associatedprotein25，SNAP25）。此外，在PFF处理HEK293-α-syn-GFP稳转细胞系诱导α-syn寡聚体的形成过程中，同样观察到了EHMT1和EHMT2的表达上调以及H3K9me2水平的升高。进一步的实验表明，PFFs导致EHMT1和EHMT2介导的H3K9me2水平的升高与α-syn寡聚体的形成过程相关。原代神经元中，抑制EHMT1和EHMT2，在不影响PFFs引起α-syn寡聚体和病理性磷酸化α-syn形成的情况下，可以显著抑制PFFs引起的H3K9me2水平的升高、突触相关蛋白PSD95、Synapsin1、vGLUT1和SNAP25表达的下降、原代神经元的形态和突触结构损伤、以及突触数目的丢失，从而减轻原代神经元的死亡。通过ChIP实验，结果显示PFF处理导致H3K9me2富集于基因PSD95、Synapsin1、vGLUT1和SNAP25的转录起始区域。另外，A-366的干预处理显著降低PFFs引起的H3K9me2富集，从而证实了EHMT1和EHMT2介导的H3K9me2对基因PSD95、Synapsin1、vGLUT1和SNAP25的调控作用。 在PFFs构建的PD模型小鼠中，通过IHC验证了PD小鼠模型的成功构建。小鼠在PFFs注射6个月后，表现出爪抓力丧失、平衡能力和精细调节能力的下降等运动功能障碍。IHC和Golgistaining染色结果表明PFFs导致小鼠神经元树突棘和突触数目的丢失、DA神经元的丧失、以及炎症反应的发生。WesternBlot和qPCR检测结果显示，PFF模型小鼠EHMT1和EHMT2转录水平及蛋白水平的上调及其介导的H3K9me2水平的升高，以及突触相关蛋白PSD95、Synapsin1、vGLUT1和SNAP25表达的下降。通过A-366腹腔给药的干预治疗，显著改善PFF模型小鼠的运动功能障碍、减少DA神经元数目的丧失、抑制炎症反应的发生，而不影响病理性磷酸化α-syn的形成和传播。WesternBlot和qPCR检测结果表明，A-366的干预治疗，同样能够抑制PFF模型小鼠中脑区域H3K9me2水平的增加，恢复突触相关蛋白PSD95、Synapsin1、vGLUT1和SNAP25的表达。此外，IHC和Golgistaining染色结果表明，A-366的干预治疗，显著缓解了PFF模型小鼠中脑黑质区域神经元树突棘以及纹状体区域突触数目的丢失。 结论：在细胞体外模型和小鼠在体模型中，PFFs通过上调EHMT1/EHMT2介导的H3K9me2水平，引发表观遗传调控的失衡，这导致了突触相关蛋白PSD95、Synapsin1、vGLUT1和SNAP25的表达受到抑制。通过特异性抑制EHMT1和EHMT2，可以纠正该表观调控的失衡，恢复突触相关蛋白PSD95、Synapsin1、vGLUT1和SNAP25的表达，从而改善神经元的突触损伤以及PFF模型小鼠运动功能的障碍，并保护了DA神经元的完整性。
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