摘要
第一部分垂体腺苷酸环化酶激活肽（PACAP）/PAC1-R在6-OHDA大鼠痛觉过敏中的作用及机制研究 目的：疼痛是帕金森病（Parkinson’sdisease,PD）常见的非运动症状，严重影响患者生活质量，由于PD疼痛的确切机制目前尚不清楚，临床上缺乏有效治疗方案。本研究利用6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine,6-OHDA）诱导的PD大鼠模型，探讨垂体腺苷酸环化酶激活肽（pituitaryadenylatecyclase-activatingpolypeptide,PACAP）在6-OHDA大鼠痛觉过敏的作用及调控机制。 方法：通过脑立体定位技术，以双侧黑质致密部为靶点损伤多巴胺能（dopaminergic,DA）神经元诱导PD大鼠模型，分为假手术（Sham）组和6-OHDA组。采用转棒实验、旷场实验、vonFrey、辐射热甩尾实验和辐射热缩足实验分别评估动物的运动能力、机械痛阈和热痛阈；运用定量PCR和westernblotting方法检测脊髓背角中PACAP及其特异性受体PAC1-R的表达情况；采用ELISA检测两组大鼠脑脊液（cerebrospinalfluid,CSF）中PACAP-38的浓度。采用药理学方法，通过鞘内注射PAC1-R的拮抗剂PACAP6-38，观察抑制PACAP的特异性受体PAC1-R对6-OHDA大鼠痛觉的影响；检测两组大鼠连续鞘内注射PACAP6-38后脊髓背角中p-CaMKⅡ/CaMKⅡ、p-ERK/ERK和p-P38/P38表达量的变化；通过免疫荧光技术观察PAC1-R和神经元标志物NeuN的共定位；采用RNA干扰（RNAi）技术，于6-OHDA造模前1周在L4-L6脊髓背角注射病毒pAAV2/9-hSyn-EGFP-3×FLAG-miR30-shRNA（Adcyap1r1）表达针对Adcyap1r1的shRNA，组织特异性敲减PAC1-R的表达；对照组注射pAAV2/9-SYN-MCS-EGFP-3×FLAG-miR30；在敲减了PAC1-R的模型上进行6-OHDA诱导PD大鼠造模，3周后观察6-OHDA大鼠痛觉变化及其对下游信号通路蛋白p-CaMKⅡ/CaMKⅡ和p-ERK/ERK的影响；鞘内注射ERK的抑制剂PD98059观察其对6-OHDA大鼠痛觉的影响；单独或联合鞘内注射PD98059和和PAC1-R的激动剂PACAP1-38观察对照动物痛觉行为变化；采用全细胞离体脊髓膜片钳技术记录两组动物L4-L6脊髓背角Ⅱ层神经元的兴奋性突触传递以及分别孵育给药PACAP6-38和PD98059前后6-OHDA组大鼠L4-L6脊髓背角Ⅱ层神经元兴奋性突触传递的变化。 结果：造模3周后，与Sham组大鼠相比，6-OHDA组大鼠掉棒潜伏期明显缩短，旷场实验中运动总距离没有变化，纹状体中酪氨酸羟化酶（TH）表达量明显降低，左后足机械回缩阈值显著降低，甩尾潜伏期和左后足热回缩潜伏期明显缩短，L4-L6脊髓背角PACAP和PAC1-R的mRNA和蛋白水平均显著升高，而Vip、Vipr1和Vipr2的相对表达量没有变化，CSF中PACAP-38浓度显著升高；鞘内注射PAC1-R的抑制剂PACAP6-38明显改善6-OHDA组大鼠的机械痛敏和热痛敏；连续鞘内注射PACAP6-38抑制上调的PACAP/PAC1-R通路降低6-OHDA大鼠L4-L6脊髓背角CaMKⅡ和ERK的激活；敲减L4-L6脊髓背角神经元中PAC1-R的表达改善6-OHDA大鼠的痛觉过敏，抑制6-OHDA大鼠的脊髓背角中CaMKⅡ和ERK的磷酸化；ERK抑制剂PD98059显著改善6-OHDA组大鼠痛觉过敏，PAC1-R激动剂PACAP1-38诱发大鼠出现痛觉过敏，提前鞘内注射PD98059缓解鞘内注射PACAP1-38诱发的痛觉过敏；膜片钳结果显示与Sham组大鼠相比，6-OHDA组大鼠脊髓背角Ⅱ层神经元sEPSCs的频率明显升高，振幅无明显差异；6-OHDA大鼠L4-L6离体脊髓片分别孵育PACAP6-38和PD98059降低了脊髓背角Ⅱ层神经元sEPSCs的频率，而不影响其振幅。 结论：1、L4-L6脊髓背角PACAP/PAC1-R通路激活增强脊髓背角神经元的兴奋性突触传递参与了6-OHDA诱导的PD大鼠痛觉过敏；2、激活的PACAP/PAC1-R信号通过ERK信号增强L4-L6脊髓背角神经元的兴奋性突触传递参与6-OHDA大鼠的痛觉过敏。 第二部分PD患者血清PACAP水平与疼痛的相关性研究 目的：探讨PD患者的血清PACAP水平与PD疼痛的关系，初步分析PD患者疼痛严重程度的预测因素。 方法：收集132例PD患者及60名健康对照的临床资料及血清样本，分为健康对照组、PD不伴疼痛组和PD伴疼痛组。通过数字评分法（numericalratingscale,NRS）评估疼痛严重程度，NRS得分将疼痛严重程度分为无痛（0），轻度（1-3），中度（4-6）和重度（7-10）；根据King’s帕金森病疼痛量表（King’sParkinson’sdiseasepainscale,KPPS）和Ford分型评估PD疼痛的特点和分类。采用ELISA试剂盒检测血清中PACAP-38的浓度。比较各组及亚组间血清中PACAP-38的水平；分析PD患者NRS和KPPS评分的相关因素，以及PACAP-38与NRS、KPPS和UPDRSⅢ（off）得分的相关性；通过Ordinallogistic回归初步分析影响PD患者疼痛严重程度的预测因素。 结果：132例PD患者中，疼痛的患病率为54%，其中骨骼肌疼痛类型为68%。PD伴疼痛组、PD不伴疼痛组以及健康对照组之间血清中PACAP-38的水平有显著差异，PD伴疼痛组血清PACAP-38水平明显高于健康对照组，较PD不伴疼痛组有升高趋势；亚组分析表明重度疼痛组血清PACAP-38水平显著高于轻度组和无痛组，中度组血清PACAP-38水平显著高于轻度组和无痛组。血清PACAP-38水平与NRS、KPPS得分以及疼痛等级均呈正相关；血清PACAP-38水平与UPDRSⅢ（off）得分无相关性；Ordinallogistic回归分析提示，长PD病程、PACAP-38水平升高和高H-Y分期是PD疼痛严重程度的预测因素。 结论：1、PD患者血清PACAP-38水平与PD疼痛程度呈正相关；2、血清PACAP-38水平升高可能是PD患者疼痛严重程度的预测因素之一。
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