摘要
目的：多发性骨髓瘤（Multiplemyeloma,MM）是第二大血液系统恶性肿瘤，已成为严重的公共卫生问题。目前以硼替佐米（Bortezomib,Btz）为基础的联合化疗是MM患者的一线治疗方案，可以显著延长患者的生存期，但其毒副作用和耐药问题很严峻。天然小分子化合物作为肿瘤治疗的一种重要策略，具有多种结构和生物活性，具有广泛的应用前景和研究价值。本研究发现了一种天然小分子化合物—安五脂素（Anwulignan），并探索了其抗MM的作用及机制，为MM的治疗提供了新的理论基础和治疗策略。 方法： 1.本研究使用CCK-8（Cellcountingkit-8）实验检测安五脂素对四株MM细胞增殖抑制的作用，并采用流式细胞术（Flowcytometry,FCM）检测安五脂素对于MM细胞凋亡和周期的影响。随后，利用小鼠体内急性毒性试验评估了安五脂素治疗剂量的安全性，在小鼠体内构建了原位MM模型，并采用活体荧光成像系统动态评估了安五脂素在体内的抗MM作用。此外，我们还使用Micro-CT扫描评价了安五脂素抑制溶骨性骨破坏的能力。最后，我们通过苏木素-伊红（Haematoxylin-eosin,Hamp;E）染色检测了安五脂素对主要器官的毒副作用。 2.本研究使用生物素（Biotin）标记安五脂素，并通过半制备高效液相色谱纯化了生物素化安五脂素，然后使用高效液相色谱（HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC）、质谱（MassSpectrometry,MS）及核磁共振波谱（NuclearMagneticResonanceSpectroscopy,NMR）对生物素化安五脂素进行鉴定。使用CCK-8法验证生物素化安五脂素对MM的增殖抑制作用。采用亲和纯化技术联合蛋白质组学鉴定到安五脂素的靶蛋白-NPM1，并通过免疫共沉淀法和蛋白质热漂移法对安五脂素与NPM1蛋白的结合进行验证。利用分子对接技术进一步模拟安五脂素和NPM1蛋白的结合能和结合构象。通过GEO（Geneexpressionomnibus）数据库分析NPM1基因对MM进展的影响，采用单因素及多因素生存分析评价了NPM1基因在MM病人预后中的价值。我们建立了ISS（InternationalStudentServices）预后模型和ISS+NPM1预后模型，并比较了二者的预后效能。使用小干扰RNA（SmallinterferingRNA,siRNA）在MM细胞系中下调NPM1的表达，检测了NPM1对MM细胞生物学表型的影响。最后我们使用高通量转录组测序（RNA-Seq）探索安五脂素在MM中的分子作用机制。 3.本研究使用相差显微镜观察安五脂素对MM细胞形态的影响，并通过westernblotting法检测其对caspase1/GSDMD通路的影响，以明确安五脂素能否诱导MM细胞焦亡。同时，使用ELISA法检测安五脂素对高迁移率族蛋白B1（HMGB1）释放的影响，利用小干扰RNA在MM细胞株中下调GSDMD的表达，以检测GSDMD蛋白对安五脂素抗MM作用的影响。另外，利用慢病毒载体表达短发夹RNA（ShorthairpinRNA,shRNA）干扰技术在鼠源MM细胞株中沉默GSDMD基因，并在C57BL6/KaLwRij小鼠中构建原位MM模型。通过活体荧光成像系统动态评估安五脂素对小鼠体内肿瘤负荷的影响，并通过流式细胞术评价小鼠脾脏及骨髓中T细胞的活化程度。 4.在体外实验中，使用计算协同作用指数（Combination-Index,CI）的方法检测安五脂素与硼替佐米、卡非佐米是否具有协同作用。体外构建卡非佐米耐药细胞株模型，通过计算卡非佐米与硼替佐米的半抑制浓度（Halfmaximalinhibitoryconcentration,IC50）鉴定耐药细胞株是否成功建立。利用CCK-8法检测安五脂素对于卡非佐米耐药细胞及复发难治患者原代CD138+细胞的杀伤作用，采用高通量转录组测序结合westernblotting法探索安五脂素克服卡非佐米耐药的机制。 结果： 1.安五脂素对四株MM细胞均有显著的增殖抑制作用，并能够显著诱导MM细胞凋亡和细胞周期阻滞。在体内急性毒性实验中，安五脂素不影响小鼠体重和主要脏器指数，具有较高的安全性。在体内实验中，安五脂素显示出抗MM作用，并且可以显著抑制溶骨性骨破坏。此外安五脂素对小鼠体内主要脏器没有明显的毒副作用。 2.通过体外酯化反应，合成生物素化安五脂素。利用HPLC、MS和NMR鉴定生物素化安五脂素的分子量和结构，CCK-8法检测该化合物具有与安五脂素相同的药理活性。利用生物素化安五脂素与链和亲霉素磁珠的特异性亲和作用，纯化靶蛋白，通过蛋白质组学鉴定到关键靶蛋白为NPM1。通过免疫共沉淀、蛋白质热漂移和分子对接技术，验证安五脂素和NPM1的结合。GEO数据分析显示，NPM1基因表达量在MM患者中随着疾病进展显著升高，生存分析结果表明NPM1基因可以作为MM病人的独立预后因子，并且有助于改善ISS预后模型的准确性。沉默NPM1可以显著抑制MM细胞的增殖活性，诱导细胞凋亡及周期阻滞于S期。高通量转录组测序显示，安五脂素与沉默NPM1影响基因转录水平变化较为相似，提示安五脂素可以靶向NPM1蛋白诱导MM细胞凋亡及周期阻滞。 3.MM细胞形态学及caspase1/GSDMD信号通路激活提示安五脂素可诱导MM细胞焦亡。ELISA结果表明，安五脂素能显著促进人源及鼠源MM细胞中HMGB1的释放。我们成功构建了稳定沉默GSDMD基因的小鼠MM细胞株，并且用于在免疫健全的小鼠中构建原位MM小鼠模型。体内实验结果显示，安五脂素能够显著抑制MM肿瘤生长，同时具有T细胞活化的作用。此外，我们发现在安五脂素诱导MM细胞焦亡及T细胞活化中，GSDMD蛋白发挥了重要作用。 4.通过在体外计算协同指数发现安五脂素与硼替佐米、卡非佐米均具有协同作用。CCK-8实验结果显示，卡非佐米耐药细胞株中卡非佐米、硼替佐米的IC50值显著增高，说明在体外成功建立了卡非佐米耐药细胞株。体外实验结果显示，安五脂素能够显著抑制卡非佐米耐药细胞及复发难治患者原代CD138+细胞的增殖，并且安五脂素可以影响TNFα/NF-κB信号通路发挥克服卡非佐米耐药的作用。 结论： 1.安五脂素具有抑制MM细胞增殖，诱导MM细胞凋亡与周期阻滞的作用。在小鼠原位MM模型中，安五脂素能够减轻肿瘤负荷，并且能够抑制溶骨性骨破坏，同时具有良好的生物安全性。 2.安五脂素靶向NPM1蛋白发挥诱导MM细胞凋亡及周期阻滞的作用。NPM1基因的表达在MM患者中随着疾病进展显著升高，NPM1能够作为MM患者的独立预后因子，并且能够提高ISS预后模型的准确性。 3.安五脂素能够激活caspase1/GSDMD信号通路诱导MM细胞焦亡并且促进HMGB1的释放。在免疫健全小鼠原位MM小鼠模型中，安五脂素可以显著减轻肿瘤负荷，活化T细胞。 4.安五脂素与硼替佐米、卡非佐米具有协同作用，并且安五脂素能够通过抑制TNFα/NFκB信号通路发挥克服卡非佐米耐药的作用。
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