摘要
研究背景 乳腺癌已成为危害女性身体健康的最大的肿瘤杀手，根据我国2023癌症统计数据报告显示：在2000至2016年期间发病率和死亡率持续增加，女性乳腺癌发病率为29.05/10万，位居女性肿瘤第一位，其中三阴性乳腺癌（Triple-negativebreastcancer，TNBC）患者是死亡率最高的乳腺癌类型，目前临床上针对TNBC仍缺乏有效的治疗靶点，为此，发掘TNBC发病新机制，寻找新的治疗靶点对TNBC的治疗具有重要意义。SSX2IP作为调节细胞分裂增殖的重要分子，我们的研究证实SSX2IP在TNBC中高表达，在TNBC细胞的分裂增殖，侵袭迁移和凋亡等生物学行为中有重要的调控作用，可作为TNBC治疗的新靶点，但目前就SSX2IP在三阴型乳腺癌生物学行为中的调控作用及机制尚缺乏系统性研究。 研究方法 1.基于TCGA数据库预测了基因SSX2IP在正常组织和乳腺癌组织中的表达差异性，并通过UALCAN分析了基因SSX2IPmRNA在不同类型乳腺癌中的表达差异。利用乳腺癌组织芯片进一步分析了SSX2IP蛋白在乳腺癌中表达水平及临床预后关联性。 2.构建基因SSX2IP敲减和过表达慢病毒，并通过细胞增殖活性检测实验，细胞侵袭实验，细胞划痕实验，克隆形成实验，细胞周期实验和细胞凋亡实验检测基因SSX2IP敲减和过表达前后，对TNBC细胞生物学行为的影响。 3.通过WGCNA加权基因共表达网络分析SSX2IP共表达的基因，发现SSX2IP与FANCI关联度最高。并基于TCGA数据库分析了基因FANCImRNA在正常组织和乳腺癌组织中的表达差异，比较了基因FANCImRNA在不同类型乳腺癌和不同临床分期中的表达差异。 4.基于基因回复，通过细胞增殖检测实验，细胞侵袭实验，细胞划痕实验，细胞周期实验和细胞凋亡实验检测不同条件下，对TNBC细胞生物学行为的影响。 5.利用免疫共沉淀（CO-IP）结合蛋白印迹（WesternBlot，WB）实验检测蛋白FANCI对FANCD2蛋白泛素化水平的调节作用；通过WB证实SSX2IP通过FANCI蛋白调节PIDDosome复合物，MDM2蛋白和P53蛋白的表达水平。 6.通过MDA-MB-231细胞构建Balb/c裸鼠皮下瘤模型，评价基因SSX2IP敲减前后对肿瘤的成瘤能力和生长抑制影响，并通过HE染色观察组织形态和炎性情况，通过免疫组化（IHC）检测Ki67蛋白水平，判断细胞活性情况，通过IHC检测蛋白SSX2IP、FANCI和通路蛋白PIDD1，RAIDD，Caspsae2，MDM2，p53的表达水平。 结果 1、TGCA数据库分析显示，SSX2IPmRNA在乳腺癌中高表达，尤其在TNBC中表达水平最高；104例TNBC组织芯片检测显示，TNBC组织的SSX2IP蛋白表达水平显著高于癌旁组织，且SSX2IP高表达的患者生存预后较差。 2、成功构建了基因SSX2IP敲减和过表达慢病毒。基因SSX2IP敲减后，TNBC细胞的增殖、迁移和侵袭能力降低，凋亡增加。过表达基因SSX2IP后，TNBC细胞的增殖，迁移和侵袭能力增强，凋亡减少。 3、GEPIA数据库生信分析结果显示，乳腺癌组织FANCImRNA表达水平显著高于癌旁组织，在不同组织类型的乳腺癌组织中，TNBC组织的FANCImRNA表达水平最高，FANCImRNA表达水平高的患者生存期较短，TNBC组织的SSX2IP和FANCImRNA表达水平呈正相关。 4、TNBC细胞在敲减SSX2IP表达后，FANCI的mRNA和蛋白表达水平明显降低，而过表达SSX2IP后，FANCI的mRNA和蛋白表达水平明显上升。 5、敲减FANCI能降低SSX2IP促进TNBC细胞增殖，迁移和抗凋亡作用，并引起G2/M期阻滞。而过表达FANCI能部分逆转SSX2IP敲减引起的TNBC细胞增殖和迁移抑制，G2/M期阻滞和凋亡作用。 这些结果提示：SSX2IP可能通过FANCI发挥对TNBC细胞增殖，迁移，细胞周期和凋亡等生物学行为的调控作用。 6、ENCORI数据库分析显示，乳腺癌细胞的FANCI和FANCD2mRNA表达水平呈正相关，FANCD2和PIDD1mRNA表达水平呈负相关，SSX2IP和PIDD1mRNAamp;nbsp;表达水平呈负相关。 7、FANCI敲减后，MDA-MB-231细胞的FANCD2蛋白的泛素化水平上调。SSX2IP或FANCI敲减后，MDA-MB-231细胞的PIDD1蛋白表达水平上调。FANCI的过表达能逆转SSX2IP敲减引起的PIDD1蛋白表达上调作用，FANCI敲减能逆转SSX2IP过表达引起的PIDD1蛋白表达下调作用。 8、SSX2IP或FANCI敲减后，MDA-MB-231细胞的RAIDD和Caspase2蛋白表达上调，过表达SSX2IP或FANCI后，MDA-MB-231细胞的RAIDD和Caspase2蛋白表达下调。FANCI敲减能逆转SSX2IP过表达引起的RAIDD和Caspase2蛋白表达抑制作用。FANCI的过表达能逆转SSX2IP敲减引起的RAIDD和Caspase2蛋白表达上调作用。 9、SSX2IP或FANCI敲减后，MDA-MB-231细胞的MDM2蛋白表达下调，p53蛋白表达上调，过表达SSX2IP或FANCI后，MDA-MB-231细胞的MDM2蛋白表达上调，p53蛋白表达下调。FANCI敲减能逆转SSX2IP过表达引起的MDM2蛋白表达上调，p53蛋白表达下调的作用。而FANCI的过表达能逆转SSX2IP敲减引起的MDM2蛋白表达下调，p53蛋白表达上调的作用。 10、裸鼠移植瘤体内研究显示，SSX2IP敲减移植瘤的体积和重量显著低于对照组移植瘤，SSX2IP敲减移植瘤的Ki67蛋白表达水平显著低于对照组移植瘤；SSX2IP敲减移植瘤的FANCI和MDM2蛋白表达水平显著低于对照组移植瘤，而PIDD1、RAIDD、Caspase2和p53蛋白的表达水平显著高于对照组移植瘤。 结论 SSX2IP在三阴性乳腺癌中高表达，SSX2IP高表达的患者生存预后较差，SSX2IP可能通过FANCI发挥对TNBC细胞增殖，迁移，细胞周期和凋亡等生物学行为的调控作用。SSX2IP发挥生物学效应的一种可能的分子机制是：SSX2IP通过上调FANCI蛋白抑制PIDD1-RAIDD-Caspase2蛋白复合物的形成，使MDM2蛋白表达上调，p53蛋白表达下调，从而抑制凋亡、促进TNBC细胞增殖。
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