摘要
研究背景： 原发性肝癌(Primarylivercancer，PLC)发病率位居肿瘤第六位，但其死亡率高居第二。肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）是最常见的肝癌病理组织类型，其预后较差，中位生存期仅6~10个月，5年生存率仅约20%。一方面，这与HCC起病隐匿相关，首次诊断多已处于中晚期；另一方面，HCC治疗手段有限，早期通过手术切除、肝脏移植可显著延长生存时间。中晚期多采用局部消融、经动脉化疗栓塞术、放疗、靶向药物及系统治疗等，但疗效较为有限。免疫疗法，特别是免疫检查点抑制剂的应用为HCC患者带来新的希望，但无论是单一还是联合用药，其整体有效率仍不足30%。肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associatedmacrophages，TAMs)在肿瘤微环境中起着重要的免疫抑制作用，它们通过多种途径参与肿瘤的发展、转移和耐药。肿瘤相关巨噬细胞具有高度的可塑性，改变其功能表型可促使其成为抗肿瘤免疫的“先锋部队”。因此，靶向肿瘤相关巨噬细胞已成为肿瘤免疫疗法的新方向。肿瘤相关巨噬细胞功能状态的差异导致其对肿瘤细胞生物学行为产生不同影响，而单细胞测序在研究肿瘤微环境、肿瘤免疫、细胞交互等方面较传统的批量转录组测序具有显著优势。 目的： 本研究旨在通过肝细胞癌单细胞转录组测序生信分析，揭示肝细胞癌肿瘤微环境免疫特征，识别调控巨噬细胞亚群向促瘤巨噬细胞方向极化的关键基因，随后通过实验验证，探索其对细胞极化表型的影响及其潜在机制，为临床肝细胞癌免疫治疗提供新靶点。 方法: 1.从GEO和TGCA数据库检索并下载肝细胞癌单细胞转录组测序和批量转录组测序数据。根据标准工作流程，使用Seurat包对单细胞测序数据进行质量控制、降维、聚类。基于已发表文献和cellmarker数据库进行细胞注释。细胞比例分析用于比较细胞浸润丰度变化。使用CellChat探索细胞-细胞相互作用。单细胞调控网络推断和聚类（Single-cellregulatorynetworkinferenceandclustering，SCENIC）分析用于预测转录因子（TF）及其调控的靶基因。Scissor和轨迹分析用于确定最能导致肿瘤不良预后的细胞亚群，并模拟各细胞亚群间的分化轨迹，找到可能调控巨噬细胞随拟时间极化的关键基因。应用基因富集分析、生存分析和免疫浸润相关性分析进行筛选和验证。最后，使用肝细胞癌病理组织提取蛋白质并检测关键基因的蛋白表达情况。 2.第一部分的生物信息学分析使我们确定了可能调控巨噬细胞极化的关键转录因子PRDM1及其靶基因PLXDC2。但其是否影响了巨噬细胞极化方向需要实验的进一步验证。因此，本部分研究将结合组织、细胞功能及动物实验三个层次进一步探索PLXDC2和PRDM1对巨噬细胞功能表型的影响。首先，我们采用肝细胞癌病理标本进行免疫组化实验分析CD163、PLXDC2和PRDM1蛋白的表达模式。在细胞功能的研究中，使用嵌入式共培养体系构建了HCC条件的肿瘤相关巨噬细胞模型，通过PCR、WB、流式细胞术及细胞爬片多重免疫荧光染色检测多种生物标志物的表达情况，判断HCC条件的肿瘤相关巨噬细胞的功能表型。随后，通过构建干预PRDM1和PLXDC2基因表达的慢病毒稳定转染细胞株，观察基因表达变化对巨噬细胞功能的影响，并使用ELISA、WB及细胞免疫荧光检测相关标志物表达变化来表征巨噬细胞功能的改变。裸鼠异种移植瘤模型的构建用于观察干扰PLXDC2表达后的巨噬细胞对肿瘤生长影响。干预一个基因后测定另一个基因的变化方向，帮助我们确定PLXDC2与PRDM1之间存在相互的调控关系，让我们对于PRDM1和PLXDC2在巨噬细胞极化调控的机制有了初步的认识。 3.在前述研究的基础上，我们希望揭示PLXDC2与PRDM1相互调控并影响巨噬细胞功能的机制。我们再次基于单细胞测序生信分析，观察PRDM1与靶基因在拟时分化中的表达量变化特点。基因调控网络分析帮助我们比较不同亚群中PRDM1的转录活性。利用STRING数据库预测可能与PRDM1互作的蛋白，并使用Cytoscope进行可视化。前期研究发现，干扰PLXDC2的表达也会对PRDM1产生影响，这引发我们对二者之间存在反馈环路的可能性进行思考。结合文献及STRING数据库的分析结果，我们推测这两个基因间可能通过JAK1-STAT3通路形成反馈调节环路。接下来，我们首先利用双荧光素酶报告基因实验来明确PRDM1对PLXDC2的转录是否具有正向调控作用。随后通过干预PRDM1和PLXDC2的表达，观察JAK1-STAK3通路蛋白的变化情况。 结果： 1.经过质量控制后，共有20个测序样本中的74742个细胞和23110个基因被纳入分析，经过降维、聚类、细胞注释和亚群分析，我们得到7种细胞类型和9个巨噬细胞亚群。细胞比例统计结果显示，肿瘤核心区域内的巨噬细胞高丰度浸润。巨噬细胞亚群分布特点及分子标志物的表达情况表明，肿瘤核心区细胞更倾向于M2样表型。细胞交互分析显示，肿瘤核心区域的巨噬细胞亚群在细胞交互的数量和强度上均占据主导地位。SCENIC分析得到肿瘤核心区域中RSS（Regulonspecificityscore，调节子特异性得分）和RAS（Regulonactivityscore，解子活性得分）得分均高的转录调节子PRDM1(+)，拟时序分析显示该调节子涵盖的644个靶基因中有101个参与了拟时间分化的调节。GO富集分析验证了这101个拟时关键差异基因参与了巨噬细胞分化的生物学过程。生存分析和免疫浸润相关性分析筛选出12个可能调控M2极化的关键基因。最终，我们选择了转录因子PRDM1和与M2浸润高度相关且具有预后意义的靶基因PLXDC2。WB检测HCC病理组织中蛋白表达结果显示，癌组织中PLXDC2和PRDM1蛋白的表达量显著高于癌旁组织（Plt;0.05）。 2.首先，CD163染色结果表明，肝细胞癌肿瘤组织具有高M2巨噬细胞浸润的特点，PLXDC2和PRDM1均在肿瘤组织间质细胞中表达最高。共培养模型建立后，PCR、WB、流式细胞术及细胞免疫荧光结果表明，相较于对照组，HCC条件下的TAMs高表达CD163和CD206，表明HCC条件下的TAMs呈现M2型极化特征，同时PLXDC2和PRDM1的mRNA和蛋白表达量也在HCC条件下的TAMs中显著上调（Plt;0.05），证实了PLXDC2和PRDM1在体外M2样肿瘤相关巨噬细胞中高表达。通过转染慢病毒质粒干预HCC条件下TAMs中PLXDC2及PRDM1的表达，检测多种生物标志物的表达情况。ELISA结果表明，干预PLXDC2或PRDM1的表达显著影响IL10及VEGF的分泌，而IL-1β及TNF-α分泌无显著变化（Pgt;0.05）。WB和细胞免疫荧光结果也表明，干预PLXDC2和PRDM1可显著影响巨噬细胞的极化方向。因此，我们确认了PLXDC2和PRDM1参与了调控巨噬细胞的极化表型。异种移植瘤模型结果显示，敲低PLXDC2后与LM3共注射的移植瘤在体积和重量上均显著低于对照组（Plt;0.05），表明PLXDC2通过影响巨噬细胞极化方向间接影响肿瘤的生长。我们对PLXDC2和PRDM1的调控关系结果表明，PRDM1对PLXDC2转录起促进作用，而PLXDC2的敲低也可能影响到TAMs中PRDM1的表达。 3.从上述结果可以看出，PLXDC2与PRDM1之间存在复杂的调控关系。拟时序分析和基因调控网络分析结果提示，PRDM1在拟时分化过程中表现出转录活性和表达量的双重改变。STRING数据库分析结果显示，STAT3与PRDM1间存在相互作用。双荧光素酶报告基因实验结果证实，过表达PRDM1后可显著增加PLXDC2的表达（Plt;0.0001）。最后，P-JAK1/JAK1和P-STAT3/STAT3比值在敲低PLXDC2和PRDM1组中均减小，而在过表达PRDM1组中比值增加，表明PLXDC2和PRDM1可能通过影响JAK1/STAK3通路影响巨噬细胞极化，同时PLXDC2可能通过STAT3通路磷酸化正反馈调节PRDM1表达。 结论： 1.PRDM1和PLXDC2在肝细胞癌肿瘤相关巨噬细胞中高表达，且与M2型巨噬细胞浸润丰度及肿瘤不良预后呈正相关。 2.PRDM1和PLXDC2在巨噬细胞极化中具有重要作用，其表达量改变显著影响巨噬细胞功能表型。 3.PLXDC2可能在巨噬细胞与肿瘤细胞交互中发挥膜受体作用，并通过调控JAK1/STAT3通路影响巨噬细胞极化。 4.PRDM1与PLXDC2间可能通过JAK1/STAT3形成反馈环路促进肿瘤相关巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化，可能为临床靶向肿瘤相关巨噬细胞提供潜在靶点。
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