摘要
肺炎克雷伯菌是一种存在于多种生态位中的机会性致病菌，广泛存在于自然界、人和动物的呼吸道和消化道。作为临床抗感染治疗中危害性病原菌，肺炎克雷伯菌耐药性传播增加了治疗成本和风险。同时，随着近代畜禽业的快速发展，高密度的养殖方式和抗生素滥用，使得畜禽养殖场成为耐药基因产生和传播的‘培养罐’，进一步加速了肺炎克雷伯菌耐药性的传播。肺炎克雷伯菌在畜禽-人-环境中的流行传播对动物健康养殖以及人类公共安全造成了严重威胁。鉴于此，本研究以我国多地畜禽养殖业中畜禽及环境来源的肺炎克雷伯菌作为研究对象，通过表型鉴定、全基因组测序以及长读长纳米孔单分子测序技术，阐明畜禽养殖业中肺炎克雷伯菌耐药流行特征及其传播的机制，同时评估肺炎克雷伯菌的毒力特征。最后，本研究利用转座子测序技术尝试性地探索了动物源肺炎克雷伯菌对替加环素耐药的新机制。 首先，本研究在2021-2023年间从全国多地区畜禽养殖场（主要包括猪、鸭、蛋鸡、肉鸡）采集样品共计1420份，共分离得到616株肺炎克雷伯阳性菌株，样品阳性率为38.73%，其中主要分离自鸡、猪粪便样品。通过药敏试验结果发现，大多数肺炎克雷伯菌都具有较为广泛的耐药谱，尤其是对于氨基糖苷类、氟喹诺酮类以及头孢类药物高水平耐药，大部分分离株为多重耐药肺炎克雷伯菌。通过耐药基因PCR鉴定结果显示，在616株肺炎克雷伯菌分离株中，37株携带碳青霉烯耐药基因blaNDM、29株携带多粘菌素耐药基因mcr、98株携带替加环素外排泵基因簇tmexCD-toprJ、以及2株携带替加环素耐药基因tet(X)，值得注意的是，部分分离株同时携带blaNDM、mcr、tet(X)以及tmexCD-toprJ中两种或三种耐药基因。接合实验表明，大部分分离株可以携带mcr、blaNDM以及tmexCD-toprJ进行跨物种转移，同时，本研究在实验室条件下将tmexCD-toprJ阳性质粒转移到大肠杆菌中，虽然接合频率较低，这意味着tmexCD-toprJ在自然条件下存在着跨种属转移的风险。 随后，本研究对29株碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌遗传特征进行分析，结合数据库临床分离株进行系统发育学分析，研究发现存在部分动物源分离株与美国人源临床分离株亲缘关系较近，并且畜禽来源中不同宿主之间存在克隆传播，推测碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌可以跨区域、时间和生态位点进行克隆传播。耐药基因遗传环境分析结果显示存在3种blaNDM变体，blaNDM-5为流行优势基因，并且其阳性质粒在多个地区多个样本中被鉴定。blaNDM-1与tmexCD1-toprJ1共存于一个IncHI1B/FIB型质粒，blaNDM-7与mcr-1共存于一个IncHI2型质粒。研究鉴定了3种mcr变体，mcr-1、mcr-8以及mcr-9，mcr-1阳性质粒具有多种质粒复制子类型，并且存在mcr-1与tmexCD1-toprJ1共存的IncHI1B/FIB型质粒。同时，研究发现IncHI1B/FIB型质粒为tmexCD1-toprJ1的优势型质粒，该质粒存在多重耐药区并具有多个插入位点，提示插入序列可能是该质粒中出现多耐药基因共存的重要因素。进一步分析遗传环境发现blaNDM、tmexCD-toprJ基因环境具有保守性，而mcr的遗传环境较为多样。 其次，本研究通过对目前畜禽养殖来源的肺炎克雷伯菌的毒力进行评估。结果发现，分离株以wzi95/KL20型为主要血清型，大部分肺炎克雷伯菌携带好氧菌素iutA、肠菌素entB以及沙门菌素iroDE，其赋予分离株摄取铁离子能力，并不具有毒力表型。通过大蜡螟试验，研究发现部分猪源分离株具有较强的毒力特征，通过对猪源分离株基因组进行毒力因子检测与评分分析，在其毒力质粒中发现了与经典毒力质粒pLVPK样质粒相似的遗传背景，携带气杆菌素iucABCD基因簇，并且在该质粒中存在着多耐药区，IS26介导多种耐药基因串联重复，这种耐药毒力质粒的出现对于公共卫生安全造成了巨大的威胁。 最后，本研究通过转座子突变测序对肺炎克雷伯菌替加环素耐药的潜在机制进行探索，研究通过对可能介导替加环素耐药的tet(A)阳性质粒进行消除，发现消除后菌株对于替加环素抗性下降，提示tet(A)的多拷贝可能促进菌株对替加环素耐药。此外，突变测序对比结果显示，共发现了11个显著变化的基因，其中3个插入突变显著降低被认为可能与耐药性有关。氨基酸突变位点预测结果显示，其177位甲硫氨酸替换为蛋氨酸可能造成功能改变。结合已有研究，我们推测肺炎克雷伯菌某些调节代谢相关基因的表达下调可能提高细菌对于四环素类药物的抗性。 综上，基于“OneHealth”理念，本研究基于单分子测序技术、微生物学技术、转座子测序技术，全面解析了畜禽养殖业肺炎克雷伯菌耐药及毒力流行特征，评估了多重肺炎克雷伯菌及耐药质粒的传播及进化风险，进一步探究了肺炎克雷伯菌对于替加环素耐药的潜在机制，为控制畜禽养殖业中肺炎克雷伯菌耐药性传播提供理论参考。
NETL