摘要
松脂是重要的工业原料，具有重要的经济和战略价值。松脂产量是一个高度可遗传性状并且在不同基因型间变异很大，同时松脂产量又受到机械损伤和外源信号物质的显著影响，揭示松脂合成的分子机制对提高松脂产量具有重要意义。马尾松（Pinus massoniana Lamb.）是我国最主要的采脂树种，然而，马尾松组成型松脂产量以及机械损伤和外源信号物质诱导松脂合成的分子调控机制仍不清楚，这些问题制约着马尾松高产脂遗传改良及脂用林高效培育。为揭示马尾松组成型与诱导型产脂的分子调控机制，本研究在已发掘出的马尾松不同产脂力种质的基础上，通过对不同产脂力种质进行生理生化、转录组和蛋白组分析，挖掘组成型产脂相关基因及调控通路；通过对机械损伤和茉莉酸甲酯处理的马尾松茎干进行形态及解剖结构观察、生理生化分析、萜烯组分测定和转录组测序，挖掘诱导型产脂关键基因及调控途径；最后，对目的基因的功能进行验证，旨在为通过遗传改良和人工林培育技术提高马尾松松脂产量提供理论依据。主要研究结果如下： 1. 生理及代谢水平对马尾松产脂力的影响 以马尾松高产脂和低产脂种质的针叶和树干木质部为材料，分析不同产脂力马尾松在光合色素含量、糖类含量、萜类合成酶活性、激素水平以及代谢组分上的差异。生理指标测定显示，不同产脂力种质在光合色素含量、可溶性糖含量、蔗糖含量和萜类合成酶活性上存在显著差异。内源激素测定显示，高产脂种质针叶中茉莉酸和赤霉素类激素水平较低产脂种质整体下降，而高产脂种质木质部中茉莉酸和赤霉素类激素水平较低产脂种质整体提高。针叶萜烯组分测定显示，茨烯、三环烯、α-松油醇、δ-杜松烯、β-桉叶烯、α-马来烯等含量在高产脂种质针叶中显著提高，而3-蒈烯、(+)-α-长叶蒎烯、长叶烯、γ-古芸烯、β-雪松烯等含量在高产脂种质针叶中显著降低。木质部代谢物测定显示，枞酸、新枞酸、去氢枞酸、α-亚麻酸、丙酮酸等代谢物含量在高、低产脂种质中存在显著差异。结果表明生理及代谢水平是影响马尾松产脂力的重要内在因素，光合色素含量、可溶性糖含量、蔗糖含量和萜类合成酶活性可作为与产脂力关联的生理指标。 2. 马尾松组成型产脂相关基因/蛋白及调控通路 对马尾松高、低产脂种质针叶进行转录组和蛋白组分析，共获得17,266个全长转录本序列和4885个蛋白，差异表达分析鉴定到3811个差异表达基因（DEGs）和1396个差异表达蛋白（DEPs）。转录组和蛋白组关联分析发现，光合作用、碳水化合物代谢、萜类生物合成以及激素生物合成相关基因/蛋白的表达水平在高、低产脂种质中存在显著差异。马尾松萜类生物合成相关基因α-TerS、CarS、GerS、α-BisS、PMK和MPDC与产脂量显著相关。进一步结合高、低产脂种质的生理特性进行综合分析，在转录、蛋白及生理水平挖掘出组成型产脂相关候选基因，包括叶绿素合酶（chlG）、己糖激酶（HXK）、蔗糖合酶（SUS）、磷酸甘油酸激酶（PGK）、二氢硫辛酰胺脱氢酶（DLD）、二氢硫辛酰胺琥珀酰转移酶（DLST）、12-氧-植物二烯酸还原酶（OPR）和茉莉酸甲基转移酶（JMT）。 对产脂高峰期（8月）和低峰期（3月）的马尾松高、低产脂种质木质部进行蛋白组测序，共鉴定到6909个蛋白，其中5995个可定量。在HM3 vs. LM3、HM8 vs. LM8、HM8 vs. HM3和LM8 vs. LM3四个比较组中，共鉴定出2984个差异表达蛋白。差异表达蛋白的KEGG通路富集及表达模式聚类分析显示，萜类生物合成、ABC转运体、植物激素生物合成和信号转导以及结构性抗性是调控马尾松组成型产脂的关键途径。鉴定出马尾松组成型产脂相关蛋白，主要包括HDS、IDI、FPPS、TPSs、ABCs、GSTs、HSPs、AOS、OPR、ACX、JAR和GID1。 3. 机械损伤和茉莉酸甲酯调控马尾松诱导型产脂的分子机制 采用机械损伤和茉莉酸甲酯（MeJA）处理马尾松3年生实生苗，通过对处理后的马尾松茎干进行解剖结构观察、生化指标和萜烯组分测定以及转录组测序，挖掘诱导型产脂关键基因及调控途径。结果显示，MeJA处理显著诱导创伤性树脂道形成；机械损伤和MeJA处理均显著提高了萜类合成酶活性，增加了茎中萜烯含量；诱导处理下，JAs变化最为明显，并随诱导程度加深JAs含量越高，说明JAs参与马尾松松脂的诱导合成。转录组分析发现，机械损伤和MeJA处理后萜类生物合成相关基因表达水平变化显著，同时，许多参与JA生物合成的关键基因在诱导后也显著上调表达，表明JA信号可能通过调控萜类生物合成相关基因的表达来促进松脂的诱导合成。诱导处理下，JA信号途径关键基因MYC2s显著上调表达，表明MYC2s可能是调控诱导型产脂的关键基因。 4. 马尾松产脂关键候选基因的功能验证 对PmHDR2、PmCYP720B2和PmCYP720B12进行克隆，其基因ORF全长分别为1464 bp、1464 bp和1467 bp。表达分析发现它们均在树干木质部中高表达，其基因表达水平与产脂量均呈显著正相关，且割脂和MeJA处理显著增强它们的表达水平。过表达PmHDR2转基因烟草株系苗高、茎粗、叶片数以及叶绿素含量显著高于野生型，并且过表达PmHDR2促进了烟草萜类物质的积累，表明PmHDR2参与萜类生物合成的调控。对PmbHLH1、PmMYC2和PmMYC3进行克隆，其基因ORF全长分别为2019 bp、2376 bp和2106 bp。组织表达分析显示它们均在嫩茎中高表达，且割脂和MeJA处理能显著增强它们的表达水平。过表达PmbHLH1、PmMYC2和PmMYC3转基因拟南芥株系生物量和苗高均显著高于野生型，并且过表达PmbHLH1、PmMYC2和PmMYC3均显著提高了拟南芥萜类合成相关基因的表达水平，改变了拟南芥体内萜类物质的含量，表明PmbHLH1、PmMYC2和PmMYC3参与调控萜类生物合成。 综上所述，本研究从转录和蛋白水平共同揭示了萜类生物合成、ABC转运体、植物激素生物合成和信号转导以及结构性抗性是调控马尾松组成型产脂的关键途径，同时光合作用和碳水化合物代谢也参与调控马尾松组成型产脂；初步揭示了机械损伤和MeJA通过JA信号调控马尾松诱导型产脂的分子机制；证明了PmHDR2、PmCYP720B2和PmCYP720B12是马尾松组成型与诱导型产脂的关键基因，并且PmbHLH1、PmMYC2和PmMYC3调控萜类生物合成。
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