摘要
作为全球第二大神经退行性疾病，帕金森病（PD）对越来越多的老年患者的身心健康构成了严重威胁。然而，目前仍然缺乏有效的治疗方法。尽管临床上的手术治疗和干细胞治疗取得了一定进展，但传统药物的生物利用率低，且常常伴随着严重的副作用以及其他并发症。这种现状使得帕金森病的治疗依然面临巨大挑战。因此，迫切需要开发出更为安全有效的治疗方法，以提高患者的生活质量并减轻他们的痛苦。 为了解决这一问题，本研究构建了一种功能性外泌体膜融合纳米颗粒递送系统，旨在共递送小干扰 RNA（siSNCA）和雷公藤甲素（T10）。siSNCA 通过 RNA 干扰途径特异性下调基因表达水平，从而抑制 α-Syn 的生成，而 T10则通过诱导细胞自噬来阻断α-Syn的聚集，并促进α-Syn寡聚体的降解。这种综合治疗策略的协同作用有望改善多巴胺能神经元的变性死亡，逆转神经退行性病变，并最终恢复帕金森病患者的运动功能。通过外泌体膜融合的设计，降低阳离子脂质体的毒性，避免核酸药物的降解，同时增强了药物的脑靶向性，使其能够穿越血脑屏障到达帕金森病的发病部位，从而更有效地发挥治疗作用。 本课题利用微流控技术将 T10 高效地加载到阳离子脂质体中，阳离子富集的正电荷能静电吸附 siRNA，通过外泌体的膜融合，实现了载体的低免疫原性和脑靶向性。体外实验证实了该递送系统具有良好的细胞摄取能力以及对 α-Syn 蛋白的下调效果。体内实验利用行为学实验探究PD小鼠的造模效果，活体成像探究其体内的药物分布，HE染色验证其对小鼠组织的安全性，最后通过免疫组化以及免疫荧光实验验证其降解α-Syn的能力。 ①首先，阳离子脂质体的制备方法通过动态光散射（DLS）进行筛选，以粒径电位为指标进行工艺的优化。结果表明，利用微流控技术制备的阳离子脂质体具有良好的粒径分布和较低的 PDI 值，且表面带有丰富的正电荷。通过高效液相色谱（HPLC）检测包封率对脂质体载药比例进行优化，确定最佳制备比例为DC-胆固醇：磷脂：T10=10：30：3，其包封率达到了80.53%。阳离子脂质体的高正电荷有利于通过静电吸附siRNA，琼脂糖凝胶电泳结果表明，最佳质量比为8/1。此外，还通过HPLC测定了48小时内载药纳米制剂T10的释放情况。 随后，再将靶向肽质粒进行细胞转染后，采用 PEG外泌体提取法制备了功能化外泌体RVG-Exo（RExo）。DLS检测RExo的粒径为58.36 nm，PDI为0.282，电位为-11.37 mV。利用脂质体挤压器将RVG-Exo与阳离子脂质体进行了膜融合。动态光 散射（DLS）测量结果显示，RExo-Lipo-T10 粒径为 132nm、PDI 为 0.163、电位为20 mV。通过荧光共振能量转移（FRET）实验，我们确定了 RExo 与阳离子脂质体的最佳质量结合比例为5：1，再使用TEM对纳米制剂的形态进行了观察，并对纳米颗粒的稳定性进行了研究。 ②在体外药效评价实验中，首先进行了细胞毒性实验。结果表明，作为载体的阳离子脂质体虽然显示一定的毒性，但是外泌体的存在降低载药阳离子脂质体的细胞毒性，这证实了该纳米颗粒具有较高的安全性。随后，通过流式细胞术和激光共聚焦实验验证了对细胞的内化效率，溶酶体逃逸实验显示，纳米颗粒可以成功避免被溶酶体吞噬，并顺利释放药物，从而提高了药物的生物利用度。最后，将不同组的药物分别作用于α-Syn-mCherry-SHSY-5Y细胞，在给药后72小时进行激光共聚焦与western blot实验验证了siSNCA-Lipo-RExo-T10在体外降解α-Syn蛋白的效果。 ③在体内实验中，首先采用尾静脉注射 MPTP诱导 C57BL/6小鼠帕金森模型，通过行为学实验验证了帕金森模型的成功构建。在注射 DIR 荧光纳米制剂后，通过活体成像系统证实了RExo纳米制剂具有较好的靶向性。治疗性药物注射后，小鼠在爬杆实验和矿场实验中展现了一定程度的帕金森症状改善。免疫荧光和免疫组织化学结果显示了小鼠脑部黑质区α-Syn蛋白水平的下降，同时Hamp;E染色结果表明，纳米颗粒不会损伤正常组织器官。 本研究旨在构建一种功能性外泌体膜融合纳米颗粒靶向递送系统。该纳米颗粒能够稳定携带siRNA和T10两种药物，并通过血脑屏障高效地靶向到病变神经元，协同降低多巴胺能神经元 α-Syn 蛋白病例物质的细胞毒性，为帕金森病的治疗提供了新的策略。
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