摘要
目的： 本研究旨在评估COVID-19康复患者特异性体液免疫和细胞免疫应答的持久性，康复患者接种灭活疫苗的安全性和适应性免疫反应；以及健康人群同源加强接种第三针SARS-CoV-2灭活疫苗对需密切关注突变株（variants of concerns, VOCs）的动态抗体应答特征与持久性。 方法： 第一部分： 前瞻性随访自华中科技大学同济医学院附属协和医院出院的COVID-19康复患者至起病一年。纵向收集76例患者的共162份外周血样本，通过化学发光免疫法（CLIA）定量检测针对核衣壳(N)蛋白或刺突蛋白(S)的特异性IgM和IgG抗体；并通过活病毒中和试验检测中和活性。其次，分离外周血单个核细胞( PBMC)，通过流式细胞术检测康复患者免疫细胞的比例、表型和功能，通过S、膜蛋白M和N三种抗原肽体外刺激培养PBMC，检测SARS-CoV-2特异性T细胞应答。 第二部分： 招募拟接种或已接种灭活疫苗的康复患者（n=51）和健康对照（n=63），收集疫苗接种前后共149份外周血样本。通过标准化问卷评估接种疫苗的安全性。分离血浆，通过CLIA法检测RBD特异性IgG抗体（Anti-S-RBD IgG）以及针对野生型（WT）和VOCs的中和抗体（NAbs）；分离PBMC，通过ELISpot检测RBD特异性记忆B细胞应答，同时检测SARS-CoV-2特异性T细胞应答。 第三部分： 招募接种三剂灭活疫苗的健康受试者（n=38），共收集63份外周血样本。收集基本资料和疫苗接种信息。根据距接种第三针疫苗的时间，将样本分为四组：接种后1-3月（n=17）、4-6月（n=9）、7-9月（n=11）和10-12月（n=26）。通过CLIA法检测Anti-S-RBD IgG抗体以及针对WT和VOCs的NAbs。 结果： 第一部分 1. 康复一年时，除Treg细胞群的比例仍偏高外，其他免疫细胞的比例、表型和功能与健康对照组相比无统计学差异。 2. 大多数患者在康复一年后可检测到Anti-N IgG（88.2%）和Anti-S IgG（90.8%），抗体滴度相对稳定；然而仅有43%和22.6%的患者存在针对WT和B.1.351的中和活性，且针对B.1.351的中和滴度明显低于WT。 3. T细胞应答的强度和广度随着时间推移逐渐下降，在康复一年时约半数患者检测不到阳性的T细胞应答。 第二部分 1. 康复患者接种灭活疫苗后不良反应总体发生率为42.9%，最常见的局部和全身不良反应分别是注射部位疼痛(31.4%)和发热（11.4%），所有机体反应是一过性、轻微的。 2. 单剂灭活疫苗即可显著提高康复患者对WT和VOCs (Alpha、Beta、Delta和Omicron)的中和能力，第二剂并不额外增加抗体反应。这种强劲的抗体反应持续至少3个月。不同年龄、性别和疾病严重程度的康复患者，针对WT和VOCs的NAbs滴度无显著差异。 3. 康复患者分泌RBD特异性IgG抗体的记忆B细胞数量显著高于接种两剂疫苗的健康人群。 4. 接种单剂疫苗后，分别有100%、100%和91.7%的康复患者可以检测到S、M和N特异性CD4+T细胞应答，66.7%可以检测到CD8+T细胞应答。CD4+和CD8+T细胞对肽库应答的宽度以及分泌细胞因子的频率均明显增加。 第三部分 1. 与接种两剂疫苗相比，接种第三针显著增加了健康人群对WT和VOCs 的中和抗体阳性率以及抗体滴度。 2. 第三针后抗体滴度随时间推移逐渐下降，二者存在线性关系。Anti-S-RBD IgG、WT、Alpha、Beta和Delta的滴度每30天平均分别下降19.80%、20.70%、18.60%、10.50%和17.40%。 3. 大部分健康人群在加强接种远期（10-12月）依然存在针对WT、Alpha、Beta和Delta比较稳定的中和抗体，但几乎无法中和Omicron，易发生突破性感染。 结论： 1. 自然感染野生型SARS-CoV-2的患者在康复一年时免疫细胞比例、表型和功能的失调已基本恢复；但体液和细胞免疫应答水平明显下降, 有必要接种疫苗提高保护力。 2. COVID-19康复患者接种灭活疫苗的安全性良好，单剂即可诱导强烈的体液免疫应答、记忆B细胞应答和特异性T细胞应答。 3. 第三剂灭活疫苗显著增加了健康人群对VOCs的中和抗体滴度，对除Omicron外的大部分突变株的中和作用稳定而持久。
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