摘要
【研究背景】 脊髓损伤（Spinalcordinjury，SCI）是一种严重的中枢神经系统（CNS）损伤，可导致损伤水平以下永久的感觉运动功能障碍。对患者家庭及社会造成巨大的负担。脊髓损伤通常被分为原发性损伤与继发性损伤两大类。原发性脊髓损伤是由直接的机械外力引起的不可逆损害。而继发性脊髓损伤则是一个潜在可逆的病理过程，然而目前的治疗方法十分局限。大量研究表明抑制继发性脊髓损伤时的炎症反应和减少神经元凋亡或是治疗脊髓损伤的关键。自噬（Autophagy），是细胞内一种重要的、高度保守的自我降解过程，通过该机制，细胞能够降解并回收受损的细胞器、长寿蛋白以及入侵的病原体，从而维持细胞内环境的稳定和生物能量的平衡。漆黄素（Fisetin）是一种天然存在的黄酮类化合物，广泛分布于多种水果和蔬菜中。既往研究证实其具有调控自噬、抗炎和抗衰老等特性。另外有研究发现抑制小胶质细胞和浸润性巨噬细胞的自噬将增强创伤性脑损伤后过度的神经炎症反应。此外，也有研究证明Fisetin可以激活AMPK从而抑制mTOR的信号传导；而AMPK-mTOR信号通路是经典的自噬调控的通路之一。 【研究目的】 本研究旨在观察Fisetin对SCI大鼠的神经修复功能，采用转录组测序（RNA-sequence,RNA-seq）的检测方式来筛选FIsetin对SCI大鼠的神经修复机制，并进一步探究Fisetin调控SCI后小胶质细胞自噬的作用及机制。为Fisetin在SCI治疗中的应用提供新的机制依据。 【研究方法】 第一章Fisetin在脊髓损伤中的作用机制 将同一批次出生10-12周的雄性SD大鼠，体重约为180-200g，随机分为3组：假手术组（Sham组），脊髓损伤组（SCI组）和脊髓损伤治疗组（Fisetin+SCI组）。Sham组仅接受椎板切除术，每日腹腔注射4μl生理盐水；SCI组采用Allen’s方法构建脊髓损伤大鼠模型，每日腹腔注射4μl生理盐水；Fisetin+SCI组采用Allen’s方法构建脊髓损伤大鼠模型，每日腹腔注射4μlFisetin（40mg/kg），腹腔注射持续时间为3天。第3天获取损伤的脊髓组织。 对以上三组进行高通量转录组测序，筛选SCI组的大鼠与Fisetin+SCI组的大鼠的差异表达基因，通过GO分析、KEGG分析和GSEA分析对差异表达基因进行生物学注释及富集分析，以探索Fisetin对大鼠脊髓损伤可能的作用机制。 通过RT-qPCR，Westernblot和免疫组织化学等实验检测自噬标志蛋白LC3-II、Beclin1和自噬底物P62的表达水平。 第二章Fisetin对脊髓损伤大鼠的神经保护作用及机制 将同一批次出生10-12周的雄性SD大鼠，体重约为180-200g，随机分为3组：假手术组（Sham组），脊髓损伤组（SCI组）、脊髓损伤治疗组（Fisetin+SCI组）和脊髓损伤治疗+自噬抑制剂（CQ：Chloroquine，自噬抑制剂）组（Fisetin+SCI+CQ组）。Fisetin+SCI+CQ组采用Allen’s方法构建脊髓损伤大鼠模型，每日腹腔注射4μlFisetin（40mg/kg）和2μlCQ（20mg/kg）；腹腔注射持续时间为3天（d）或7天（d）。 术后7d取材，获取损伤的脊髓组织。行HE染色确定各组大鼠脊髓组织的受损面积；采用Nissl染色确定脊髓前角运动神经元的存活数量。通过采用Basso、Beattie、Bresnahan评分标准（BBB评分）、足迹实验和游泳测试，在术后0天、3天、7天、14天、21天及28天对各组大鼠的运动功能进行评估。 术后3d取材，获取损伤的脊髓组织。通过Westernblot和免疫组织化学实验检测凋亡相关标志物Cleaved-caspase3、Bcl-2和Bax的表达水平，以检测大鼠SCI后神经元的凋亡情况。 术后3d取材，获取损伤的脊髓组织。通过Westernblot和免疫组织化学实验检测促炎性小胶质细胞标志物iNOS和促炎因子IL-6、TNF-α的表达水平，以检测SCI大鼠的炎症反应情况。以小鼠的小胶质细胞系BV2细胞为实验对象，采用脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）激活BV-2小胶质细胞的神经炎症模型，通过CCK8检测不同浓度Fisetin对正常及活化的BV-2小胶质细胞生存率的影响；利用不同浓度Fisetin（10μM，20μM，40μM）及CQ（20μM）处理BV-2小胶质细胞，将BV-2小胶质细胞随机分为四组：control组、LPS组、Fisetin+LPS组和Fisetin+LPS+CQ组；通过RT-qPCR，Westernblot，免疫组织化学实验和ELISA实验检测促炎性小胶质细胞标志物iNOS、CD68和促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平，以检测Fisetin和自噬抑制剂CQ对小胶质细胞炎症反应的调控情况。 第三章Fisetin处理的小胶质细胞对神经元凋亡的影响 我们进一步研究小胶质细胞介导的炎症反应对神经元凋亡作用的影响，以小鼠的神经元细胞系HT22细胞和BV-2小胶质细胞为实验对象，利用Transwell培养板建立HT22神经元和BV-2小胶质细胞的体外共培养系统，通过Westernblot实验，检测了与细胞凋亡相关的蛋白质，包括Cleaved-caspase3、Bcl-2和Bax的表达水平。 第四章Fisetin调节小胶质细胞自噬的潜在机制 将同一批次出生10-12周的雄性SD大鼠，体重约为180-200g，随机分为3组：假手术组（Sham组），脊髓损伤组（SCI组）和脊髓损伤治疗组（Fisetin+SCI组）。Sham组仅接受椎板切除术，每日腹腔注射4μl生理盐水；SCI组采用Allen’s方法构建脊髓损伤大鼠模型，每日腹腔注射4μl生理盐水；Fisetin+SCI组采用Allen’s方法构建脊髓损伤大鼠模型，每日腹腔注射4μlFisetin（40mg/kg），腹腔注射持续时间为3天。第3天获取损伤的脊髓组织。采用Westernblot检测AMPK/mTOR信号通路相关蛋白AMPK,p-AMPK,mTOR,p-mTOR的表达水平。利用不同浓度Fisetin（40μM）及p-AMPK抑制剂（dorsomorphin：CompoundC,CpdC,p-AMPK抑制剂）（5μM）处理BV-2小胶质细胞，采用Westernblot检测AMPK/mTOR信号通路相关蛋白AMPK,p-AMPK,mTOR,p-mTOR的表达水平。以检测Fisetin调节小胶质细胞自噬的潜在机制。 【研究结果】 第一章Fisetin在脊髓损伤中的作用机制 我们对SCI组和Fisetin+SCI组在术后第3天收集的样本进行了转录组测序。以plt;0.05且|log2(foldchange)|gt;1.5的筛选条件对SCI组与Fisetin+SCI组进行差异基因筛选，与SCI组相比，Fisetin+SCI组共有536个差异表达基因（其中226个下调，310个上调）。此外，KEGG分析表明这些差异表达基因主要富集在炎症相关的通路上，如细胞因子-细胞因子受体相互作用、IL-17信号通路、TNF信号通路和NOD样受体信号通路。此外，GSEA分析显示Fisetin治疗组显著富集在促进自噬、促进巨自噬和巨自噬调节相关的信号通路上。这些观察结果表明，自噬可能是Fisetin影响SCI的潜在机制。为了进一步验证这一结论，我们在术后第3天评估了自噬底物蛋白p62以及自噬标志物LC3-II和Beclin1的表达。我们使用IBA-1标记来表示小胶质细胞的促炎表型。免疫荧光染色显示，与Sham组相比，SCI组展示了较低比例的p62阳性的小胶质细胞。此外，Fisetin+SCI组与SCI组相比，p62阳性的小胶质细胞的比例进一步降低。为了评估LC3-II的表达水平，与Sham组相比，SCI组的脊髓中LC3-II阳性的小胶质细胞的比例更高；而与SCI组相比，Fisetin治疗后进一步增加了的LC3B阳性的小胶质细胞的比例。Westernblot分析显示，与Sham组相比，SCI组的LC3-II/LC3-I比率和Beclin-1的表达水平更高。而经过Fisetin治疗进一步增加了LC3-I向LC3-II的转化并升高了Beclin-1的表达水平。P62作为自噬底物蛋白，其表达水平在SCI后显著低于Sham组；Fisetin治疗进一步降低了p62的表达水平，表明Fisetin激活了SCI后的自噬表达。同样，Beclin1和LC3B的mRNA表达水平在SCI组中高于Sham组。而Fisetin治疗后导致Beclin1和LC3BmRNA表达水平进一步增加。 第二章Fisetin对脊髓损伤大鼠的神经保护作用及机制 2.1Fisetin促进SCI后大鼠运动功能恢复 在SCI后7天通过HE染色评估坏死脊髓组织的范围，并使用尼氏染色评估神经元存活水平。HE染色的结果显示，与Sham组相比，SCI组的大鼠显示出明显的脊髓损伤区域。而Fisetin+SCI组的组织切片在SCI后显示脊髓组织损伤范围减少。统计分析表明，与SCI组相比，Fisetin+SCI组的大鼠保留了更多的脊髓组织。此外，使用尼氏染色对神经元变性进行分析，来确定脊髓前角存活的运动神经元数量。与Sham组的大鼠相比，SCI组的前角运动神经元中的Nissl体数量显著减少。而与SCI组相比，Fisetin+SCI组的前角运动神经元中的Nissl体数量得到了显著保留。这些研究证明Fisetin能够减少神经元损伤并促进脊髓组织的形态恢复。然而，自噬抑制剂CQ阻断了Fisetin的上述作用。我们进一步通过三种行为学测试探索了桑黄素在SCI后对运动功能的影响。BBB评分结果表明，相较于Sham组，三组脊髓损伤后的大鼠的BBB评分均显著下降。然而，单纯Fisetin治疗的SCI大鼠在后肢运动功能上展现出明显的改善。在游泳测试中，Sham组的大鼠维持最高的游泳评分，而SCI组在整个28天的评估期间分数较低。与SCI组和Fisetin+SCI+CQ组相比，Fisetin+SCI组在SCI后7到28天的游泳分数显著增加。同样，在足迹分析中，Fisetin+SCI组在7到28天的行为学恢复显著增强，特别是在SCI后28天时后肢运动功能的显著恢复。这些发现表明，Fisetin在SCI后显著增强了运动恢复。同样的，CQ干预后减弱了Fisetin在SCI大鼠运动功能恢复上的有益效果。这些研究证明了Fisetin能够减少神经元损伤并促进脊髓组织的形态学恢复以及运动功能的恢复，而CQ诱导的自噬抑制逆转了Fisetin在SCI后的有益作用。 2.2Fisetin抑制SCI后神经元凋亡 在SCI3天后，我们对各组脊髓中神经元的凋亡程度进行了检测。免疫荧光染色显示，与Sham组相比，SCI组脊髓损伤部位神经元的Cleaved-caspase3密度显著增加。与SCI组相比，Fisetin治疗能够降低神经元的Cleaved-caspase3的表达。然而，CQ处理后能显著削弱了Fisetin减轻神经元凋亡的影响。随后，我们采用TUNEL染色作为评估大鼠脊髓细胞凋亡的指标，并结合神经细胞标记蛋白NeuN，对神经元凋亡进行检测，TUNEL染色的结果揭示，与Sham组相比，SCI组中凋亡的神经细胞的数量显著增加。相反，Fisetin治疗7天后，TUNEL阳性的神经元数量与SCI组相比显著减少。然而，CQ处理后显著削弱了Fisetin减轻神经元凋亡的影响。同时，我们利用Westernblot分析评估了第3天Bax、Cleaved-caspase3和Bcl-2的表达水平。众所周知，Bax/Bcl-2比例和Cleaved-caspase3表达水平与神经元凋亡正相关。与Sham组相比，SCI组的Bax/Bcl-2比例和Cleaved-caspase3表达水平显著上升。然而，Fisetin治疗后，SCI引起的Bax/Bcl-2比例和Cleaved-caspase3表达水平升高程度明显减少。然而与Fisetin+SCI组相比，Fisetin+SCI+CQ组中的Cleaved-caspase3蛋白表达水平和Bax/Bcl-2比例更高。总的来说，这些发现表明Fisetin在减轻SCI后脊髓神经元凋亡中起到了保护作用。此外，自噬抑制后能够降低Fisetin对神经元凋亡的保护作用。 2.3Fisetin在体内外减少LPS介导的BV2细胞数量和促炎细胞因子的释放 在体内实验中，通过免疫荧光实验和Westernblot分析发现SCI后促炎性小胶质细胞及促炎因子IL-6和TNF-α显著增加；而与SCI组相比，Fisetin治疗后促炎性小胶质细胞及促炎因子IL-6和TNF-α表达水平显著降低；同样的，CQ逆转了Fisetin减轻炎症反应的作用。在体外试验中，我们通过RT-qPCR，Westernblot，免疫组织化学实验和ELISA实验检测促炎性小胶质细胞标志物iNOS、CD68和促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平，在LPS处理后，促炎性小胶质细胞标志物iNOS、CD68和促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平升高，Fisetin+LPS组与LPS组相比，炎症反应减轻；而Fisetin+LPS+CQ组与Fisetin+LPS组相比，炎症反应又增强。 第三章Fisetin处理的小胶质细胞对神经元凋亡的影响 我们通过BV-2小胶质细胞和HT22神经元共培养系统研究Fisetin介导的小胶质细胞自噬对神经细胞影响。通过Westernblot分析发现与LPS处理组相比，在与Fisetin和LPS预处理的小胶质细胞共培养的HT22神经元的凋亡蛋白Bax/Bcl-2比例和Cleaved-caspase3表达水平降低。而与Fisetin+LPS预处理的小胶质细胞共培养的HT22神经元相比，与Fisetin+LPS+CQ预处理的小胶质细胞共培养的HT22神经元的凋亡蛋白Bax/Bcl-2比例和Cleaved-caspase3表达水平升高。 第四章Fisetin调节小胶质细胞自噬的潜在机制 我们通过Westernblot分析，结果表明大鼠脊髓损伤后损伤区脊髓组织中的AMPK-mTOR信号通路激活，这表明在p-AMPK/AMPK比例增高的同时伴有p-mTOR/mTOR比例的降低，而与SCI组相比，Fisetin治疗进一步激活了脊髓组织中的AMPK-mTOR信号通路，而且AMPK抑制剂CpdC能够显著抑制Fisetin引起的AMPK-mTOR信号通路的激活。 【研究结论】 1、通过RNA-Seq技术得到Fisetin可以通过调控自噬来影响脊髓损伤。 2、使用Fisetin治疗SCI大鼠，可显著改善其运动能力， 3、Fisetin能够通过促进促炎型小胶质细胞的自噬作用，有效降低SCI后的炎症反应并减缓神经元凋亡，从而促进SCI后脊髓组织的修复。 3、Fisetin可以通过AMPK-mTOR信号通路增加SCI后的自噬作用。
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