摘要
畜禽养殖业中，因抗生素使用而产生的细菌耐药性和药物在畜禽体内的残留及其引起的生态环境污染已经严重影响了畜禽养殖业的健康发展。随着“禁抗令”的发布，源于微生物资源的饲料添加剂迎来了新机遇。其中酵母培养物（Yeast culture，YC）作为一种绿色、无污染的微生态饲料添加剂，已广泛的运用到了反刍动物生产中。酵母培养物能够促进瘤胃微生物区系平衡，起到营养和保健作用，同时发现它可以调节动物的脂肪分配。但其组成复杂且主要有效成分未明确，严重限制其应用，基于此团队利用代谢组学技术筛选出对酵母培养物中的有效组分，如松二糖等。而松二糖具有改善动物的营养分配，影响脂肪的沉积的潜力。但关于松二糖对反刍动物瘤胃发酵及脂肪的影响需要进一步研究。因此，本研究通过体外瘤胃发酵试验及体内动物试验，利用 16S RNA 高通量测序、转录组分析、代谢组分析等研究方法，探究松二糖及在YC基础上补充松二糖对绵羊瘤胃发酵、生长性能、血液指标及脂肪代谢等影响，以阐明松二糖在反刍动物体内代谢的规律，揭示YC的作用机制，为促进抗生素替代品的开发提供理论依据和技术支持。 试验一：松二糖及酵母培养物对绵羊体外瘤胃发酵功能的影响 本章试验旨在通过反刍动物瘤胃体外培养技术，探究松二糖及YC对绵羊体外瘤胃功能的影响，并筛选最适剂量来进行体内试验。采用两因素试验设计，两因素分别为剂量和发酵时间，共设 10 个处理组分别为对照组CON和 4 个不同添加剂量松二糖组分别为TUR10（松二糖添加量为 10 mg/kg.DM）、TUR20（松二糖添加量为 20 mg/kg.DM）、TUR40（松二糖添加量为 40 mg/kg.DM）、TUR80 （松二糖添加量为 80 mg/kg.DM）、酵母培养物组YC（YC含量为 625 mg/kg.DM）、在YC基础上添加 4 个不同松二糖添加剂量分别为YC + TUR10（松二糖添加量为 7.34 mg/kg.DM）、YC + TUR20（松二糖添加量为 17.34 mg/kg.DM）、YC + TUR40（松二糖添加量为 37.34 mg/kg.DM）、YC + TUR80 （松二糖添加量为 77.34 mg/kg.DM）。于不同时间点 3，6，12，24，48 h进行取样，测定不同时间点样品的瘤胃发酵指标，并对 12、48 h的样品进行菌群多样性及代谢物进行测定。 试验结果表明瘤胃发酵指标均受到了剂量与时间之间的互作影响，各发酵指标均随时间的上升发生了显著性变化，松二糖及在YC基础上补充松二糖的添加对比于对照组均显著的升高了瘤胃内 VFA 及产气量（p ＜ 0.05），而且在 12 h 之后所有YC补充松二糖组的VFA均高于单独补充松二糖组。单独补充松二糖时可以降低瘤胃内 NH3-N 浓度，而且在 24 h 时 TUR40、TUR80 两组均显著低于对照组（p ＜ 0.05），YC 组及 YC 补充松二糖组均显著的高于对照组（p ＜ 0.05），而YC补充松二糖组对比于YC组随着剂量的上升而低于YC组。瘤胃微生物菌群结构受到了松二糖及 YC 补充松二糖的显著性影响（p ＜ 0.05）。对比于对照组松二糖组的TUR3、TUR4两组可以显著的提高普雷沃氏菌属（Prevotella）及月形单胞菌属（Selenomonas）（p ＜ 0.05）。YC 基础上补充松二糖更可提高瘤胃内的琥珀酸弧菌属（Succinivibrio）及鳞球菌属（Sphaerochaeta）（p ＜0.05）。螺旋体门（Spriochaetes）及其含有的鳞球菌属（Sphaerochaeta）是YC组及YC补充松二糖组特有的优势菌门及菌属并显著的高于对照组及松二糖组（p ＜ 0.05）。 通过瘤胃代谢组学结果发现在单独补饲松二糖时可以显著的增加瘤胃内的叶酸（Folinic acid）、吡哆醇（Pyridoxine）（p ＜ 0.05）含量，这些代谢物显著富集叶酸和维生素 B6 的代谢通路（p ＜ 0.05）。YC 可以对瘤胃液中的酪氨酸代谢及萜、哌啶和吡啶生物碱的生物合成起到显著调节作用（p ＜ 0.05）。YC 补充松二糖可以对生物素代谢、酪氨酸代谢及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成起到显著调节作用（p ＜ 0.05）。对比于 YC 组 YCTUR 组的差异代谢物可以显著富集在色氨酸代谢及泛酸和辅酶 A 生物合成（p ＜ 0.05）。根据以上结果，筛选出 40 mg/kg.DM 及 YC + 37.34 mg/kg.DM 两个剂量来进行后续体内试验。 试验二：松二糖及酵母培养物对绵羊生长性能、血液指标及脂肪代谢的影响的研究 根据体外试验结果，选取 40 mg/kg.DM及 YC + 37.34 mg/kg.DM两个添加剂量来进行 2 × 2 的全因子试验设计。选取 24 只体况良好体重相近的小尾寒羊♀×澳洲白♂杂交一代公羊（20 ± 1 kg），分为 4 组,每组 6 个重复,每个重复 1只羊，分别为对照组（CON）、松二糖组（TUR）、酵母培养物组（YC）和酵母培养物补充松二糖组（YCTUR），预饲期 15 天饲养期 114 天并于 115 天进行屠宰，每隔36天进行一次采血称重用于记录平均日增重并保存血液用于后续血液指标测定，屠宰当日测定屠宰指标及肉品质相关指标，采集被最长肌用于测定肌肉营养物质含量、脂肪酸含量、代谢组及转录组的测定。 结果表明试验羊屠宰重及胴体重受到了松二糖及酵母培养物之间显著的互作效应（p ＜ 0.05），对比于对照组三个处理组均可以提高绵羊屠宰率及肌肉重，并可以降低背膘厚度但差异不显著。YC及YCTUR组均可以显著降低试验羊背膘厚度（p ＜ 0.05）。TUR组对比于对照组显著的提高了绵羊被最长肌的pH值及肌内脂肪含量（p ＜ 0.05）。 血液指标结果表明松二糖可以对氧化应激指标及炎症指标具有缓解作用但差异并不显著。YCTUR组可以显著的升高血液中 36 d的TOS（总氧化态）降低108d的MDA（丙二醛）（p ＜ 0.05）、并可以显著性降低 72d的INOS（一氧化氮合酶）及 108d的COX-2（环氧化酶）（p ＜ 0.05）。 根据转录组结果分析，三个处理组均筛选出了与脂肪代谢相关的差异基因（FOXO1、SREBF1、SCD、LDLR、ADCY3等），并且各组GO及KEGG通路富集分析均显著富集到了胰岛素信号通路、胰高血糖素信号通路、cAMP信号通路等脂肪代谢相关的代谢通路（p ＜ 0.05）。 代谢组结果表明松二糖组筛选出的差异代谢物 11-脱氢皮质酮（11-Dehydrocorticosterone）、延胡索酸（Fumaric acid）、苹果酸（Malic acid）及磷酸胆碱等相关物质均可以通过糖脂代谢来促进脂肪沉积，KEGG富集结果表明三个处理组均可以显著富集到胰岛素信号通路、胰高血糖素信号通路等脂肪相关代谢通路。并且关联分析发现FOXO1与磷酸胆碱相关类物质成显著正相关（p ＜ 0.05）。 补饲松二糖及YC均可以改善试验羊背最长肌的脂肪酸比例增加不饱和脂肪酸的占比。松二糖还可以显著的升高肌肉中饱和脂肪酸（C10∶0、C11∶0、C12∶0、C13∶0、C14∶0、C21∶0）及不饱和脂肪酸（C14∶1、C16∶1）的相对含量（p ＜ 0.05）。 综合以上研究结果，松二糖作为YC的功效物质，可以增加瘤胃内有益菌的相对丰度、调节微生物多样性、促进有益代谢物的生成、改善瘤胃内环境；并可以改善绵羊生长性能及肉品质，其效果与YC相似。另外发现松二糖在脂肪沉积方面具有很大潜力。同时在YC基础上补饲松二糖两者可发生正向互作，增强YC的营养保健作用。
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