摘要
链霉菌具有生产各种活性次级代谢产物的巨大潜力，是新药创制的重要源泉之一。其次级代谢产物的结构鉴定（尤其是绝对构型的解析）是天然药物化学研究的重要部分，也是开展生物活性评价和构效关系研究的重要前提。此外，这些次级代谢产物的生物合成路径和酶学机制研究也一直是天然药物化学家关注的热点。本论文对两株链霉菌的次级代谢产物进行了化学结构鉴定和生物合成相关的研究，另外针对喹唑霉素和波希米胺的生物合成途径进行了探索。该论文的主要研究内容分为以下四个章节。 第二章对Streptomyces sp.Py50次级代谢产物进行了详细研究，得到了 13个化合物。综合运用NMR、MS和X单晶衍射数据分析阐明了所有化合物的化学结构，其中包括6个新的邻烷基偶氮霉素二聚体（1-6），2个新的化合物（7-8）和5个已知化合物（9-13）。此外，我们还推测了邻烷基偶氮霉素二聚体1-6的生物合成途径。活性筛选结果表明，化合物1、5和6对絮状表皮癣菌有活性，其 IC50值分别为 51.24、23.15 和 10.15μM。 第三章报道了一个分离自链霉菌Streptomyces sp.KIBW85的新颖的含10个手性中心的28元大环内酯科博霉素，其平面结构通过NMR和MS数据分析确定。通过菌株基因组测序、基因组草图的生物信息学分析和基因敲除实验，确定了科博霉素的生物合成基因簇。基于聚酮合酶中结构域的排列对科博霉素的生物合成途径进行了推导，并发现了两个稀有的异丁酰辅酶A和2-异丁基丙二酰辅酶A模块参与其骨架的构建。由于大环结构本身的柔性和立体化学的复杂性，通过对负责其生物合成的酮基还原酶（KRs）的指纹序列分析、化学衍生化及NMR数据分析等多种方法确定了科博霉素的10个手性中心。选择24株癌细胞对科博霉素和其衍生物15进行细胞毒活性测试，结果发现科博霉素对人骨髓单核细胞白血病细胞有很好的抑制活性，其IC50值为86 nM;化合物15对其中七种癌细胞具有选择性抑制活性。此外，从生产科博霉素的聚酮合酶中发现了一个缺乏立体化学诊断特征指纹（W残基或LDD基序）的酮还原酶（KR7）,根据化学鉴定和体外酶反应结果均显示其催化生成B2型产物，这说明KR7的立体选择性不符合基于酮还原酶氨基酸序列的经典立体结构鉴定规则。为了探究自然界中缺乏诊断指纹的KRs立体控制的规律，我们对该类KRs进行了统计分析，并选择了 5个具有异常立体控制的KRs进行体外酶反应，并验证其手性选择性。最后，根据体外酶促反应、统计分析和定点突变等实验结果显示，缺乏诊断指纹且负责还原无α-取代的二酮底物的KRs基本都生产A型产物，而负责还原α-取代二酮底物的KRs在控制α-取代基的立体特异性方面较差，而需通过体外酶反应或者核磁数据分析来判断其还原产物的构型。因此，我们提出了一种针对缺乏诊断指纹的KRs的立体化学预测方案。 在第四章中，我们对分离自链霉菌KIB-1714的两个新骨架喹诺里西啶类生物碱喹唑霉素A和B的生物合成起源进行了基于同位素标记实验的初步探索。将 13C 标记的前体（包括 CH313COONa,13CH3COONa,13C6-L-赖氨酸，13C6-D-葡萄糖，[1-13C]-D-核糖，13C3-甘油，[2-13C]-丙酮酸）喂养到菌株KIB-1714的发酵液中，标记结果表明喹唑霉素的生物合成起源于赖氨酸，5-磷酸核糖和乙酸单元。最后，根据其化学结构和喂养结果，我们推测了喹唑霉素的生物合成途径，该途径区别于植物中喹诺里西啶类生物碱的骨架构筑方式，说明喹唑霉素的生物合成是一类全新的生物合成途径。 在第五章中，我们对来源于Streptomyces sp.KIB-1663的波希米胺的生物合成进行了研究。通过对菌株KIB-1663的基因组测序和基因组草图的生物信息学分析，发现了波希米胺的生物合成基因簇。该基因簇在白色链霉菌宿主中异源表达后，生产了一个在四氢吡咯环上缺少甲基修饰的新波希米胺类似物。为探索波希米胺中4-甲基的来源，我们进行了腺苷结构域氨基酸选择性的酶活测定和底物喂养实验，这些结果证实了波希米胺中的4位甲基来源于（2S,5S）-5-甲基脯氨酸。此外，两个关键的后修饰基因被敲除和回补，从所得突变菌株中分离得到3个中间产物或支路产物。基于上述实验结果，推测了波希米胺的生物合成路径。 综上所述，本论文从链霉菌野生型菌株、异源表达菌株和突变菌株中分离鉴定了 30个代谢产物，含15个新化合物。科博霉素立体构型的详细阐述和分析为如何运用多种方法确定复杂大环内酯的立体结构提供了指导和参考，也对后续利用生物信息分析预测I型聚酮合成酶催化的聚酮化合物的立体构型具有重要意义。同位素标记前体喂养实验和提出的途径为鉴定喹唑霉素生物合成基因并阐明其详细的生物合成机制奠定了基础。波希米胺的生物合成研究发现了（2S,5S）-5-甲基脯氨酸上的甲基由甲基转移酶介导，为(2S，5S）-5-甲基脯氨酸的生物合成研究提供了思路。
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