摘要
研究显示结直肠癌是人类常见的恶性肿瘤之一，其发病率居于世界第三位，死亡率高居世界第二位，目前针对结直肠癌已有多种治疗方法，但是肿瘤细胞产生耐药性往往是导致治疗失败的原因之一。Wnt/β-catenin信号通路是槐耳发挥其抵抗肿瘤效应的信号通路之一，也是与细胞自噬发生有关的信号通路之一，本研究将在细胞水平上观察槐耳如何在具有耐药性的结直肠癌细胞上发挥抗肿瘤效应，验证槐耳能提高耐药细胞对药物敏感性的结论，以期为临床上逆转耐奥沙利铂化疗的结直肠癌提供新的研究思路。 目的： 本研究旨在探讨槐耳是否通过影响细胞自噬进而影响耐奥沙利铂结直肠癌细胞的耐药性，验证槐耳是否通过 Wnt/β-catenin 信号通路调控细胞自噬影响耐奥沙利铂结直肠癌细胞的耐药性，为传统中药槐耳在结直肠癌治疗过程中的临床疗效提供实验依据。 方法： 本实验采用耐奥沙利铂的结直肠癌细胞 (HCT-8/L) 和结直肠癌细胞 (HCT-8) 进行研究。 1、采用细胞计数试剂盒-8 (CCK-8) 检测槐耳作用 24 h及48 h 后，对HCT-8和HCT-8/L生存活力的影响。 2、将细胞分为5 组：HCT-8组、HCT-8/L组、HCT-8/L+6 mg/mL槐耳组、HCT-8/L+9 mg/mL槐耳组、HCT-8/L+12 mg/mL 槐耳组，待细胞复苏至完全贴壁状态后按上述分组分别培养 24 h 后，采用 Western blotting (WB) 检测自噬相关蛋白( P62、LC3-Ⅱ) 、Wnt/β-catenin 通路相关蛋白 (Wnt 3a、β-catenin) 和P-gp的表达水平。 3、按上述分组培养细胞 24 h 后，采用实时定量聚合酶链反应( qRT-PCR) 检测细胞耐药相关基因 MDR1 mRNA的表达水平。 4、按上述分组培养细胞 24 h后，采用免疫荧光染色( IF) 和吖啶橙( AO) 染色的方法检测细胞自噬水平的改变。 5、应用氯喹( CQ) 作为自噬抑制剂。将细胞分为4 组：对照组、槐耳组 (12 mg/mL)、CQ 组 (20 μmol/L)、槐耳 (12 mg/mL) 联合 CQ (20 μmol/L) 组，采用WB、免疫荧光染色和AO染色的实验方法检测各组细胞自噬水平的改变，同时采用 qRT-PCR 法检测各组细胞耐药相关基因MDR1 mRNA表达水平的变化。 6、应用Wnt agonist 1 作为Wnt 通路激动剂。将细胞分为4 组：对照组、槐耳组 (12 mg/mL) 、Wnt agonist 1 组 (10 mmol/L) 、槐耳 (12 mg/mL) 联合Wnt agonist 1 (10 mmol/L) 组，采用免疫荧光染色和AO染色的实验方法检测各组细胞自噬水平的变化，采用 WB 法检测各组细胞自噬相关蛋白 (P62、LC3-Ⅱ) 、Wnt/β-catenin通路相关蛋白 (Wnt 3a、β-catenin) 及P-gp表达水平的变化，同时采用qRT-PCR法检测各组细胞耐药相关基因MDR1 mRNA表达水平的变化。 7、采用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提实验，将细胞分为3组：HCT-8 组、HCT-8/L 组、HCT-8/L+12 mg/mL 槐耳组，采用 WB 法检测各组细胞核β-catenin表达水平的变化。 8、采用CCK-8 法检测经12 mg/mL槐耳处理后的 HCT-8/L细胞对奥沙利铂的敏感性。 结果： 1、CCK-8 实验显示槐耳作用24 h后对HCT-8 和HCT-8/L的细胞IC50值分别为14.12±0.022 mg/mL和15.44±0.016 mg/mL，槐耳作用48 h 后细胞 IC50值分别为 9.448±0.019 mg/mL 和 11.45±0.021 mg/mL。槐耳作用后 HCT-8 和 HCT-8/L 细胞生存活力显著下降，说明槐耳对 HCT-8 和HCT-8/L细胞有显著的抗增殖作用 (P＜0.05) 。 2、WB实验检测P62、LC3-Ⅱ、Wnt 3a、β-catenin 和P-gp表达水平变化，结果显示与HCT-8细胞相比，HCT-8/L细胞中Wnt/β-catenin信号通路处于激活状态，细胞自噬水平降低，P-gp表达水平较高 (P＜0.05) ，差异具有统计学意义。与不加槐耳的HCT-8/L细胞相比，槐耳能够显著抑制HCT-8/L细胞Wnt/β-catenin信号通路，增强细胞自噬水平，显著降低P-gp表达 (P＜0.05) ，差异具有统计学意义。 3、qRT-PCR 实验结果显示，与 HCT-8 细胞相比，HCT-8/L 细胞中MDR1 mRNA 表达水平显著较高 (P＜0.05) ，但是伴随着槐耳浓度的增高，HCT-8/L 细胞中 MDR1 mRNA 表达水平显著降低 (P＜0.05) ，差异具有统计学意义。 4、AO染色和免疫荧光染色实验结果显示，与HCT-8细胞相比，HCT-8/L细胞自噬水平显著降低 (P＜0.05) ，差异具有统计学意义；且随着槐耳浓度的增加，HCT-8/L细胞自噬水平显著升高 (P＜0.05) ，差异具有统计学意义。 5、加入自噬抑制剂氯喹后，AO染色、免疫荧光染色和WB实验显示，槐耳组的细胞自噬水平显著高于对照组 (P＜0.05) ，氯喹组细胞的自噬水平显著低于对照组 (P＜0.05) ，但两种药物联合作用组的细胞自噬水平显著高于氯喹组 (P＜0.05) ，差异具有统计学意义。上述实验结果提示槐耳能增强细胞自噬水平。 加入自噬抑制剂氯喹后， WB和qRT-PCR实验结果显示，槐耳组的P-gp和MDR1 mRNA 表达水平显著低于对照组 (P＜0.05) ，但氯喹组细胞的 P-gp 和 MDR1 mRNA 表达水平显著高于对照组 (P＜0.05)，氯喹与槐耳联合作用组的P-gp和MDR1 mRNA表达水平显著 (P＜0.05) 低于氯喹组，差异有统计学意义。以上实验提示槐耳通过增强细胞自噬水平来影响HCT-8/L细胞的耐药性。 6、应用Wnt/β-catenin 信号通路激动剂Wnt agonist 1 后，相关实验结果显示，与对照组相比，槐耳组对信号通路的激活作用显著减弱 (P＜0.05) ，Wnt agonist 1 组对Wnt/β-catenin 信号通路的激活作用显著增强 (P＜0.05) ，但与 Wnt agonist 1 组相比，Wnt agonist 1 与槐耳联合作用组对Wnt/β-catenin信号通路的激活作用显著减弱 (P＜0.05) ，差异具有统计学意义。 与对照组HCT-8/L细胞相比，槐耳组的自噬水平显著升高 (P＜0.05) ， Wnt agonist 1 组的自噬水平显著降低 (P＜0.05) ，但Wnt agonist 1 与槐耳联合作用组的细胞自噬水平显著高于 Wnt agonist 1 组 (P＜0.05) ，差异具有统计学意义。 提示Wnt agonist 1 可以激活Wnt/β-catenin 信号通路，并抑制细胞自噬水平的发生，但与槐耳联合作用后槐耳可以抑制 Wnt/β-catenin 信号通路，并减弱Wnt agonist 1 对细胞自噬的抑制作用。 WB和qRT-PCR实验对P-gp 和MDR1 mRNA的检测结果显示，对照组 HCT-8/L 细胞的 P-gp 和 MDR1 mRNA 表达水平显著高于槐耳组 (P＜0.05) ，但对照组 HCT-8/L 细胞的 P-gp 和 MDR1 mRNA 表达水平显著低于Wnt agonist 1 组 (P＜0.05) ，Wnt agonist 1 与槐耳联合作用组的 P-gp和MDR1 mRNA 表达水平显著低于Wnt agonist 1 组 (P＜0.05) ，差异有统计学意义。上述实验提示槐耳可以通过抑制 Wnt/β-catenin 信号通路增强细胞自噬水平影响HCT-8/L细胞的耐药性。 7、细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提实验结果显示，HCT-8 细胞核 β-catenin 的表达水平显著低于 HCT-8/L细胞 (P＜0.05) ，应用槐耳后HCT-8/L 细胞核 β-catenin 的表达量显著下降 (P＜0.01) ，差异具有统计学意义，提示槐耳可以影响β-catenin入核。 8、CCK-8 实验结果显示，在奥沙利铂作用 24 h 下的 HCT-8/L 细胞IC50值为7.58 μg/mL，而应用槐耳后的HCT-8/L细胞并在奥沙利铂作用24 h 下细胞的IC50值为3.11 μg/mL，提示槐耳可以显著增强HCT-8/L细胞对奥沙利铂的敏感性 (P＜0.05) ，差异具有统计学意义。 结论： 槐耳通过 Wnt/β-catenin 信号通路增强细胞自噬水平调节结直肠癌细胞的耐药性。
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